Hidratos de Carbono. Actividade da β- galactosidase (P. ONPG)

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1 Hidratos de Carbono Objectivo Provas Fermentativas Actividade da β- galactosidase (P. ONPG) Identificar microrg. anaeróios facultativos. Fermentação r. bioquímica Identifica microrg. q podem usar a lactose c/o fonte de carbono produtora de energiua, em q as moléculas orgânicas são aceitadores finais de e -. Hidrato de carbono Comp.Org. ácido + H 2 O/CO 2 - β-galactosidase + enzima de Meio utilizado Reagente ou R. Positiva R. Negativa Meio líquido c/ nutrientes Hidrato de carbono específico de ph Tubo de Durham detectar produção de gás. Vermelho de Fenol Púrpura de Bromocresol Rosa/Amarelo e produção de gás Fermentação alcoólica produção de gás, s/ mudança de cor S/ mudança de cor S/ produção de gás. transporte p/ interior Meio c/ água destilada Lactose ONPG ONPG o-nitrofenil-β-dgalactopiranosídeo, c/o substracto p/ a enzima (incolor) ONPG (hidrólise) o- nitrofenol Amarelo, em meio alcalino Incolor P. de Kligler Iron Agar ou de Triple Sugar Iron Agar Identificar s géneros de Enterobacteriaceae e p/ distinguir esta família de outros Bacilos Gram -. Avalia fermentação de hidratos de carbono e produçãoi de H2S. Hidrólise do amido Amido = amilose + amilopectina, por hidrólise forma dextrinas, glicose e maltose - α-amilase TSI: [glicose]= 1%, [lactose] >1%, vermelho de fenol (presença de ácidos), tiossulfato de NA (substrato p/ formar H2S), sulfato de Fe (detectar H2S). Kligler: igual ao TSI + [sacarose]> 1%. (meio em rampa) Cilindro amarelo (ácido) e Rampa vermelha (Base) - Glicose fermentada; Cilindro amarelo (ácido) e rampa Amarela (ácida) fermentação da lactose/sacarose e glicose. Cilindro vermelho (base) e rampa amarela (ácida) não fermentou os hidratos de carbono; Produção de gás fracturas no meio de cultura; Produção de H 2 S enegrecimento (o H 2 S liga-se ao Ferro originando sulfureto de ferro q precipita. - Iodo (complexo azula qd contacto c/ o amido) Iodo+ meio c/amido+crescimento bacteriano zona clara Iodo+ meio c/amido+crescimento bacteriano permanece azul.

2 Proteínas, Aminoácidos e enzimas P. do Sulfureto de Hidrólise da Gelatina Hidrólise da Caseína Hidrogénio Objectivo Capacidade de produção de H2S a partir de a.a. sulfurados ou compostos sulfurados inorgânicos. Capacidade do microrg. excretar uma enzima capaz de degradar a gelatina. Esta resulta da degradação do colagénio. Usada p/ diferenciar microrg e p/ determinar a sua patogenicidade. Capacidade do microrg. excretar uma enzima capaz de degradar a caseína. Esta é a prot. Mais importante do leite Cisteína dessulfarase Tiossulfato reductase Agar SIM (q tem cisteína), c/ Tissulfato de sódio (substrato sulfurado). (é um meio semi-sóliodo, q permite avaliar a mobilidade e a produção de indol) Sulfato ferroso amoniacal (Fe(NH4) 2 SO 4 ) indicador da presença de H 2 S. Gelatinase Inoculação p/ picada em meio nutritivo em tubo, c/ 12% de gelatina. Incubação 37ºC durante h; 4ºC durante 30min ou em gelo durante 3-5min. Protease Agar Milk agar nutritivo suplementado c/ leite, um meio opaco. - - Precipitado negro insolúvel (o H2S-incolor- ao combinar-se c/ o Fe precipita. Gelatinase + meio líquido após refrigeração Perda da opacidade, devido á hidrólise e formação de a.a. solúveis e n coloidais. S/ alteração. Gelatinase - meio resolidifica Manutenção da opacidade do meio.

3 Objectivo Provas IMViC ( Indole, Methyl-red, Voges-Proskauer,Citrate) P. Indol P. do Vermelho Capacidade de degradar o a.a. triptofano Triptofanase (marcador bioquímico) Meio c/ triptofano, ex. Água Peptonada R. de Kovac s coloca-se nas paredes do tubo para n se misturar c/ o meio. de Metilo Oxidação da glicose e manutenção de concentrações elevadas de produtos finais ácidos. P. de Voges- Proskauers Capacidade de produção de produtos finais n ácidos, ex. acetilmetilcarbinol (acetoína) P. do Citrato Capacidade de usar o citrato como única fonte de carbono - - Citrato Permease (transporte do MR-VP (methyl-red, proskauers) vermelho de metilo (pto de viragem a ph=4, p/ vermelho) MR-VP R.de Barritt s (40% KOH e sol de α-aftol em etanol abs) Anel vermelho na superfície Vermelho (ph< 4) Rosa/Vermelho (dps de 15min) Amarelo Amarelo (ph >4) Ausência de cor (ex. Enterococcus) citrato para o interior do micror.) Citrase (citrato ác. Oxaloacético + acetato ác. Pirúvico + CO 2 ) Meio Citrato ou de Simmons (tubo em rampa)* Azul de Bomotimol Crescimento na rampa + cor azul Ausência de Crescimento + cor * meio em rampa, pq o O 2 é necessário p/ utilização do citrato. Qd este é utilizado o micror. produz CO 2, q se combina c/ o Na, formando carbonato de sódio, o q faz aumentar o ph e virar o indicador p/ azul. verde

4 Descarboxilação da Lisina Desaminação da Fenilalanina Redução de Nitratos Objectivo Remoção do grupo carboxilo de 1 Remoção do grupo amina da molécula org. e utilização destas aminas fenilalanina, c/ produção de p/ síntese de outras moléculas ; reacção favorecida em meio ácido e anaeróbio, pq na remoção do grupo ácido aumentam o ph do meio. ác.orgânicos (q podem ser usados em reacções de síntese), água e NH + 4. Distinguir bactérias q desaminam a fenilalanina c/ produção de ác. fenilpirúvico Descarboxilase da lisina Desaminase da fenilalanina Lisina + Glicose+ Iindicador+ Óleo mineral (p/ impedir q o O 2 atinja as bactérias) Ocorre na ausência de O 2. Os microrg. usam os nitratos (NO 3 - ) ou os sulfatos (SO 4 2- ) p fornecer O 2 e funcionar c/o aceitadores finais de e -, na formação de energia: os nitratos são reduzidos a nitritos (NO 2 - ). Alguns ainda podem actuar nos nitritos c/ produção de NH 4 + ou N 2. - Caldos de nitratos: 0,5% de Nitrato de potássio 0,1% de Agar (impede a difusão de O 2 - ambiente anaeróbio) Púrpura de Bromocresol Cloreto de Ferro Solução A ác. Sulanílico Solução B α-naftilamina 1º) Fermentação da glicose meio ácido: Púrpura Amarelo, 2º) Activa enzimas ph sobe: Amarelo Púrpura. N há mudança de cor N há mudança de cor. Composto verde (cloreto de ferro + ác.fenilpirúvico) Vermelho Reacção + Ausência de mudança de cor -2 hipóteses *: 1º) nitratos-nitritos- azoto ou amónia: adicionar Zn n ocorre mudança Reacção + 2º) adicionar Zn vermelho Reação - *A cultura não muda de cor: o microrg pode ter enzimas q reduzem os nitritos a azoto ou amónia e a reacção dá negativa, ou então os nitratos n foram reduzidos. Assim, adiciona-se ao meio zinco, que reduz os nitratos e muda o meio p/ vermelho, logo se não ocorreu redução o meio tornase vermelho c/ o Zn (reacção negativa), porém se os nitritos forma reduzidos, a adição de Zn n altera o meio e considera-se reacção positiva.

5 Objectivo Prova da Urease Capacidade de degradar a ureia. Identificar espécies de Proteus relativamente a bact entéricas lactose negativas. Prova da Oxidase Identificar microrg c/ base na actividade da enzimas citocromo oxidase. Identifica bact aeróbias, anaeróbias facultativas e microaerófilas. Distinguir grupos de Bacilos Gram negativo patogénicos. Urease Citocromo oxidase: O 2, p/ redução, forma H 2 O e citocromo oxidado. Prova da Catálase Prova da Coagulase Avaliar a degradação do peróxido de hidrogénio, q leva à morte das células. Microrg aeróbios, anaeróbios facultativos ou microaerófilos, que usam o oxigénio c/o aceitador final de electrões. Catálase: H 2 O 2 /O 2 - H 2 O + O 2 Capacidade de coagulação do plasma sanguíneo. Distinguir espécies patogénicas de Staphylococcus de espécie n patogénicas. É um bom indicador da patogenicidade do S. Aureus. Coagulase Meio de Ureia de Christensen. - Meio em rampa c/ H 2 O 2. Plasma + anticoagulante ( Vermelho de Fenol (amarelo). Rosa (ureia origina amónia q é alcalina). Reagente das oxídases ( dihidrocloreto de tetrametil p-fenilenodiamina) Rosa Castanho Negro (na superfície das colónias) Amarelo. S/ mudança de cor ou rosa ligeiro. oxalato, citrato ou heparina) - - Libertação de bolhas de gás. Ausência de bolhas de gás. Nos microrg catálse -, a enzima q degrada o superóxido é a superóxido dismutase. Coágulo ( 2/6/24 h dps) N forma coágulo.