étodos de contagem microbiana

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1 étodos de contagem microbiana André Fioravante Guerra Métodos de contagem microbiana Valença, 1ª Edição, p. Disponível em:

2 çã MÉ TODOS DÉ CONTAGÉM MICROBIANA Todo método de contagem microbiana deve ser validado e comprovado como eficaz para esta finalidade. Alguns métodos já são utilizados há muito tempo e a eficácia deles já é comprovada. Dente estes, pode-se citar: contagem em placas, contagem pela técnica de tubos múltiplos, contagem em câmara de Neubauer etc. Atualmente, com o avanço tecnológico na área da computação e técnicas moleculares, há muitos métodos rápidos de contagem microbiana. Todos estes métodos devem ter sua eficácia comprovada. Para isso, eles devem equivaler aos métodos convencionais e serem capazes de gerar resultados seguros. Há disponível uma diversidade de métodos rápidos de detecção microbiana. Estes métodos, na maioria das vezes, são métodos indiretos, mas fornecem resultados precisos em um curto intervalo de tempo. A maioria destes métodos são baseados em kits comerciais. Aos quais os fabricantes informam o procedimento de uso. Normalmente, são bastante simples de usar, muitas vezes, nem precisa de um profissional especializado em microbiologia de alimentos e um laboratório de microbiologia. As desvantagens dos métodos rápidos é o custo, normalmente análises por testes rápidos são bem mais custosas que pelos métodos convencionais. Alguns métodos necessitam de equipamentos auxiliares e softwares computacionais para realização da leitura. Estes necessitam ser constantemente calibrados e validados utilizando métodos de referência.

3 DILUIÇA O DÉ AMOSTRAS Os alimentos podem conter diferentes quantidades de microrganismos, podendo oscilar de zero até bilhões. Os métodos de contagem microbianos devem ser capazes de contar qualquer nível de contaminação. Para isso, a estratégia utilizada é diluir a amostra, desta forma, a quantidade de microrganismo também é diluída. Desta forma, em alguma diluição será possível realizar a contagem. Normalmente, as diluições são realizadas com fator de diluição 10. Usualmente, os procedimentos de análise orientam a diluição de 1mL de alíquota em 9 ml de diluente apropriado. Para análise de alimento, a primeira diluição deve ser feita transferindo 25g ou ml do alimento para 225 ml de diluente. Este procedimento é realizado para obter melhor amostragem dos alimentos. Outras diluições podem ser realizadas se determinadas previamente pelo laboratório. Porém, deve-se manter a proporção de 1:9 para manter o fator de diluição de 10 vezes. Na Tabela 1 está mostrado algumas diluições utilizadas para contagem de microrganismos em alimentos. Tabela 1 Diluições de amostras de alimentos e bebidas Volume de alíquota (g ou ml) Volume de diluente (ml) 0,1 0, Na Figura 1 está mostrado um sistema de diluição até 10-6 (0,000001g/mL). Figura 1 Diluição de amostra.

4 Entendendo as diluições Para preparar a diluição 10-1, deve-se transferir 25g ou ml para 225 ml de diluente. Desta forma, esta é a diluição que contém 0,1g ou ml de amostra em 1 ml de solução. Por conseguinte, para preparar a diluição 10-2, deve-se transferir 1mL da diluição 10-2 para outro tubo contendo 9 ml de diluente. Ao transferir uma alíquota de 1mL, na verdade está transferindo 0,1g ou ml de amostra. Esta será diluída mais 10 vezes. Assim, a diluição 10-2 é a que contém 0,01g ou ml de amostra em 1mL de solução. Na Tabela 2 está mostrado a quantidade de amostra em cada nível de diluição. Tabela 2 quantidade de amostra em cada nível de diluição por mililitro. Nível da diluição Quantidade de amostra por mililitro (g ou ml) , , , ,00001 Preparo das diluições Para diluição das amostras, utiliza-se solução salina a 0,85% ou água peptonada a 0,1% estéril. Os solutos adicionados à água de tem objetivo de manter a isotonia entre o citoplasma celular e o diluente. Desta forma, evita-se a osmose entre estes dois meios. Alguns alimentos necessitam de outros tipos de diluição. Na Tabela 3, está mostrado alguns tipos de diluições especiais.

5 MÉ TODOS DIRÉTOS DÉ CONTAGÉM MICROBIANA CONTAGEM EM PLACAS A contagem em placas é o método mais comum de contagem de microrganismos utilizada nos laboratórios de microbiologia. Baseia-se na capacidade dos microrganismos se reproduzirem quando estão em meio de cultura apropriado e na temperatura ótima de crescimento. A multiplicação microbiana, após período de tempo de 24 a 48 horas, atinge bilhões de bactérias. O acúmulo destas bactérias em um único loco da placa forma uma colônia visível ao olho humano. O resultado é expresso como UFC (Unidade Formadora de Colônia) por unidade (peso, volume, área etc). Para expressar o resultado, é necessário contar as unidades formadoras de colônias. Em uma placa de Petri, é possível contar até, aproximadamente, 300 UFC. Os manuais de análises e as legislações específicas para microbiologia de alimentos estipulam limite máximo e mínimo de contagem. Normalmente, o limite é entre 25 e 250 UFC, porém alguns outros limites podem ser utilizados para algumas análises como, ou UFC/placa. O limite máximo de contagem é estipulado devido a dificuldade de contagem de placas contendo muitas UFC e o limite mínimo, devido a significância estatística do ensaio. Para obter resultado mais significativo, a inoculação de cada diluição é executada em duplicata. Portanto, o resultado de cada diluição, é a média da contagem das duas placas. As formas mais comuns de executar a técnica são em profundidade e superfície. Porém, algumas variações são bastante úteis, como a inoculação em microgota. TÉCNICA EM PROFUNDIDADE Alíquota de 1mL de cada diluição é transferida para placa de Petri vazia e estéril. Posteriormente, o meio de cultura mantido líquido em banho termostático a C é adicionado à placa. A homogeneização é realizada com movimentos suaves em forma de 8 sobre a bancada. Após solidificação, as placas são incubadas na temperatura ótima de crescimento microbiano.

6 Na Figura 2 está mostrado a inoculação em profundidade Figura 2 Inoculação em profundidade. Cálculo e expressão dos resultados regra de três 1 Passo encontrar uma diluição entre os limites de contagem do método. Neste caso, será utilizado limite mínimo de 25 e máximo de 250 UFC. Portanto, a diluição selecionada deve ser a Passo calcular a média das contagens: Média = = Passo a diluição 10-3 significa que há 0,001g ou ml de alimento em 1 ml de solução. Portanto, deve-se fazer uma regra de três para transformar em UFC por grama ou mililitro de alimento. 43 UFC ,001g ou ml x UFC x = g ou ml Resultado = 4,3x10 4 UFC/g ou ml

7 Cálculo e expressão dos resultados fórmula Alternativamente, pode-se utilizar a seguinte fórmula matemática para calcular o resultado. Resultado = média x 1 nível de diluição x 1 volume da alíquota Assim, Resultado = 43 x x 1 1 Resultado = Resultado = 4,3x10 4 UFC/g ou ml Exemplo 1: <1 UFC ,1g X g 0,1x <1 X <1/0,1 X <10 UFC/g Exemplo 2: Exemplo 3: 10-1 >250 > Exemplo 4: 10-1 >250 > >250 > Exemplo 5: 10-1 >250 > >250 > >250 > ,1g X g 0,1x = 95 X = 95/0,1 X = 950 X = 9,5 x10 2 UFC/g ,01g X g 0,1x = 95 X = 95/0,01 X = 9500 X = 9,5 x10 3 UFC/g ,001g X g 0,1x = 95 X = 95/0,001 X = X = 9,5 x10 4 UFC/g > ,001g X g 0,1x >250 X >250/0,001 X > X >2,5 x10 5 UFC/g

8 TÉCNICA EM SUPERFÍCIE Alíquota de 0,1mL de cada diluição deve ser transferida para placa de Petri já contendo meio de cultura sólido. Posteriormente, a alíquota é espalhada sobre o meio com auxílio de alça espalhadora (bastão tipo hockey ou alça de Drigalsky) até absorção completa da alíquota pelo meio. Após, as placas são incubadas na temperatura ótima de crescimento microbiano. O volume máximo de alíquota que um meio de cultura, quando contido numa placa de Petri de 9,1cm de diâmetro, consegue absorver é 0,3mL. Normalmente, na inoculação em superfície, utiliza-se alíquota de 0,1mL. Porém, há casos que necessita inocular 1 ml de cada diluição, neste caso, pode-se inocular 4 placas com volumes de: 0,3+0,3+0,3+0,1mL ou 0,25+0,25+0,25+0,25mL. Na Figura 3 está mostrado a inoculação em superfície Figura 3 Inoculação em superfície.

9 Cálculo e expressão dos resultados regra de três 1 Passo encontrar uma diluição entre os limites de contagem do método. Neste caso, utilizaremos entre 25 e 250. Portanto, selecionaremos a diluição Passo calcular a média das contagens: Média = = Passo a diluição 10-3 significa que há 0,0001g ou ml de alimento em 1 ml de solução. Porém, a alíquota inoculada foi de 0,1mL, então: 1mL ,001g ou ml 0,1mL y = 0,0001g ou ml y 4 Passo fazer uma regra de três para transformar em UFC por grama ou mililitro de alimento. 43 UFC ,0001g ou ml x UFC x = g ou ml Resultado = 4,3x10 5 UFC/g ou ml Cálculo e expressão dos resultados fórmula Pode-se utilizar fórmula matemática para calcular o resultado. Resultado = média x 1 nível de diluição x 1 volume da alíquota Assim, Resultado = 43 x x 1 0,1 Resultado = Resultado = 4,3x10 5 UFC/g ou ml

10 Exemplo 1: ,1 g ml X ,1 ml X = 0,01 g de alimento inoculado <1 UFC ,01g X g 0,01x = <1 X <1/0,01 X <100 UFC/g Exemplo 2: ,1 g ml X ,1 ml X =0,01 g de alimento inoculado 95 UFC ,01g X g 0,01x = 95 X = 9500 X = 9,5 x 10 3 UFC/g Exemplo 3: 10-1 >250 > ,01 g ml X ,1 ml X = 0,001 g de alimento inoculado 95 UFC ,001g X g 0,001x = 95 X = X = 9,5 x 10 4 UFC/g Exemplo 4 : 10-1 >250 > >250 >250 0,01 g ml X ,1 ml X = 0,001 g de alimento inoculado >250 UFC ,001g X g 0,001x >250 X > X > 2,5 x 10 5 UFC/g Exemplo 5 : ,1 g ml X ,1 ml X =0,01 g de alimento inoculado 13 UFC ,01g X g 0,01x = 13 X = 13/0,01 X = 1,3 x 10 3 UFC/g est. Obs- est. significa que o resultado foi estimado, visto que a contagem está abaixo do limite mínimo do ensaio.

11 TÉCNICA EM MICROGOTA Alíquota de 0,025ml (25µL) de cada diluição deve ser transferida para placa de Petri já contendo meio de cultura sólido. Posteriormente, a placa é deixada em repouso sobre uma superfície plana até absorção da alíquota pelo meio. Após, as placas são incubadas na temperatura ótima de crescimento microbiano. A contagem em microgota possui como vantagens a economia de meio de cultura, tempo e espaço. Porém, é necessário utilizar uma micropipeta calibrada, pois o volume de inoculação é muito pequeno. Na Figura 4 está mostrado a inoculação em superfície Figura 4 Inoculação em profundidade.

12 Cálculo e expressão dos resultados regra de três 1 Passo encontrar uma diluição entre os limites de contagem do método. Neste caso, deve-se utilizar limite mínimo de 10 e máximo de 70. Portanto, deve-se selecionar a diluição Passo calcular a média das contagens: Média = = Passo diluição 10-3 significa que há 0,001g ou ml de alimento em 1 ml de solução. Porém, a alíquota inoculada foi de 0,025mL, então: 1mL ,001g ou ml 0,025mL y = 0,000025g ou ml y 4 Passo fazer uma regra de três para transformar em UFC por grama ou mililitro de alimento. 43 UFC ,000025g ou ml x UFC x = g ou ml Resultado = 1,72x10 6 UFC/g ou ml Cálculo e expressão dos resultados fórmula Pode-se utilizar fórmula matemática para calcular o resultado. Resultado = média x 1 nível de diluição x 1 volume da alíquota Assim, Resultado = 43 x x 1 0,025 Resultado = Resultado = 1,72x10 6 UFC/g ou ml

13 Exemplo 1: ,1 g ml X ,025 ml X = 0,0025 g de alimento inoculado <1 UFC ,0025g X g 0,0025x = <1 X <1/0,0025 X < 400 UFC/g Exemplo 2: ,1 g ml X ,025 ml X =0,0025 g de alimento inoculado 95 UFC ,0025g X g 0,0025x = 95 X = 95/0,0025 X = 3,8 x 10 4 UFC/g Exemplo 3: 10-1 >250 > ,01 g ml X ,025 ml X = 0,00025 g de alimento inoculado 95 UFC ,00025g X g 0,00025x = 95 X = 95/0,00025 X = 3,8 x 10 5 UFC/g Exemplo 4 : 10-1 >250 > >250 >250 0,01 g ml X ,025 ml X = 0,00025 g de alimento inoculado >250 UFC ,00025g X g 0,00025x >250 X > 250/0,00025 X > 1,0 x 10 6 UFC/g Exemplo 5 : ,1 g ml X ,025 ml X =0,0025 g de alimento inoculado 2 UFC ,0025g X g 0,0025x = 2 X = 2/0,0025 X = 8,0 x 10 2 UFC/g est. Obs- est. significa que o resultado foi estimado, visto que a contagem está abaixo do limite mínimo do ensaio.

14 Cálculo e expressão dos resultados calculador eletrônico Pode-se utilizar o calculador eletrônico disponibilizado no site: Link para download: 1 Passo preencher a massa e o volume do diluente utilizado para realizar a primeira diluição; 2 Passo indicar o limite mínimo e máximo do ensaio; 3 Passo digitar a contagem de cada placa inoculada; 4 Passo digitar a alíquota inoculada profundidade (1mL), superfície (0,1mL) e microgota (0,025mL); 4 Passo assinalar com um x a campo da diluição que se encontra dentro do limite da contagem. No caso de ausência de crescimento nas placas, é necessário assinalar com um x o campo: ausência de crescimento nas placas. Da mesma forma, se na última diluição inoculada, a contagem ultrapassar o limite máximo de contagem, é necessário assinalar com um x o campo: incontáveis.

15 Atualmente, o sistema de normatização ISO, estabelece uma nova forma de calcular o resultado. O cálculo deve ser realizado como média ponderada de duas diluições. Assim, há maior significância do resultado, pois duas diluições sucessivas são utilizadas o cálculo. Cálculo e expressão dos resultados como média ponderada Utiliza a seguinte fórmula: Resultado = x V (n1 + 0,1 n2)d Em que: x - número de colônias em todas as placas selecionadas; n1 número de placas selecionadas na primeira diluição; n2 número de placas selecionadas na segunda diluição; V é o volume de inóculo em cada placa, em mililitros; d - nível de diluição correspondente à primeira diluição selecionada (a suspensão inicial é uma diluição). Assim, Então, Diluição Contagem (UFC) x = => x = 206 V = 1mL (profundidade) / 0,1mL (superfície) n1 = 2 n2 = 2 d = 10-1 => 0,1 Substituindo, considerando inoculação em superfície Resultado = 206 0,1 (2 + 0,1(2))0,1 = 9,4x10 3 UFC/g ou ml

16 CONTAGEM EM CÂMARA DE NEUBAUER A grande vantagem deste método de contagem microbiana é o fato de obter resultado já no momento da execução da técnica. Ou seja, não é necessário incubação por um período de horas, como ocorre nos métodos de contagem em placas. Por isso, é um método bastante útil para contagem de microrganismos em processos de fermentação. Para contagem, utiliza-se uma placa denominada câmara de Neubauer. A contagem é feita com auxílio de um microscópio óptico utilizando a objetiva de 40 ou 100x. A câmara é calibrada para conter um volume específico de inóculo de 0,0001mL, por isso, o resultado pode ser expresso por unidade de volume ou peso de amostra. Para executar a técnica, é necessário diluir a amostras numa proporção de 1:1 com azul de metileno ou eritrosina. Após homogeneização, transfere-se uma alíquota para a mesa da câmara de forma a cobrir toda superfície da leitura. O campo de leitura de uma câmara de Neubauer está mostrado na Figura 5. Figura 5 Campo de leitura de uma câmara de Neubauer Pode-se observar que a placa é dividida em 9 quadrantes, cada um deles contém 25 subquadrantes. Cada quadrante pode ser separado em 3 tipos. As diferentes divisões dos quadrantes servem para contar microrganismos de diferentes tamanhos.

17 Cada aresta do campo de leitura da câmara mede 3mm. Portanto, a área total da placa mede 9mm 2. Com a lamínula, o poço de leitura fica com uma profundidade de 0,1mm. Portanto, o volume total da placa é de 0,9mm 3. Para contagem microbiana, normalmente seleciona-se apenas 1 dos 9 quadrantes, neste caso, o volume selecionado para leitura é de 0,1mm 3 (0,9mm 3 /9). No quadrante selecionado para contagem, contar pelo menos 5 sub-quadrantes (os dos cantos superiores, os dos cantos inferiores e o quadrado central). Com os valores obtidos na contagem dos 5 sub-quadrantes, determinar o valor do quadrado médio, que é a média aritmética dos quadrantes contados. O valor do quadrante médio deve ser multiplicado por 25, que é o número total de subquadrantes contidos no quadrante de contagem. O valor obtido está em um volume de 0,1mm 3. Convenientemente, este valor deve ser transformado para cm 3, pois 1cm 3 equivale a 1mL. Em contrapartida, 1cm 3 equivale a 1000mm 3. Portanto, o número de células obtido na contagem, está em 0,0001mL. Então, pode-se assumir que para expressar o resultado em células por ml, pode-se multiplicar o número de células contadas pelo fator de Assim, o resultado já estará expresso em células/ml. Para obter o resultado final, ainda falta multiplicar o número de células/ml pelo fator de diluição inicial da amostra (amostra + corante). Há casos em que é necessário diluir a amostra antes de fazer a mistura com o corante. Isso ocorre quando o número de células é muito alto. Neste caso, o resultado final deve ser multiplicado pelo fator de diluição: Fator de diluição = 1 nível de diluição

18 Cálculo e expressão dos resultados 1 Passo encontrar o tipo de quadrante mais adequado para a contagem. Selecionar e contar as células contidas em, pelo menos, 5 sub-quadrantes Quad 1 = 50 células Quad 2 = 20 células Quad 3 = 40 células Quad 4 = 90 células Quad 5 = 10 células Total = 210 células 2 Passo calcular o quadrado médio Quad médio = = 42 3 Passo calcular o quadrado total Quad total = = Passo transformar para células/ml Quad total = = Passo corrigir o fator de diluição inicial da amostra Quad total = = Resultado = 2,1x10 7 células/ml Cálculo usando o calculador eletrônico Disponível no site: Download link: Item Calculador contagem em câmara de Neubauer. Valença, 1ªEd., 2016.exe 1 Passo preencher o número de sub-quadrantes selecionados para contagem; 2 Passo anotar a contagem obtida em cada sub-quadrante; 3 Passo indicar os volumes de amostra e corante utilizado; 4 Passo assinalar com um x a diluição selecionada para a contagem 5 Passo o resultado será calculado automaticamente.

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20 MÉ TODOS INDIRÉTOS DÉ CONTAGÉM MICROBIANA TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS É um método estatístico de contagem microbiana. A unidade de expressão do resultado é número mais provável de unidade formadora de colônia por grama ou mililitro (NMP/g ou ml). Há tabelas específicas para análise microbiológica de água que expressa o resultado como NMP/100 ml. A tabela de número mais provável para alimentos, estabelece a inoculação de 3 níveis de diluição em 3 tubos. Por isso, são denominadas tabelas de número mais provável por grama ou ml, para séries de 3 tubos com inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001g ou ml. Neste caso, deve-se inocular 3 tubos de cada diluição com 1mL cada. Para detecção dos tubos positivos, é necessário um meio de diferenciação. Isto pode ser conseguido com adição de um tubo de Duhran invertido no interior de meio, como ocorre na análise de coliformes pela técnica de tubos múltiplos. Na Figura 6 está mostrado a técnica de tubos múltiplos. Figura 6 inoculação pela técnica de tubos múltiplos

21 A técnica de tubos múltiplos é bastante útil para detecção de poucas quantidades de microrganismos. Esta técnica permite detecção de até 0,3NMP/g ou ml de alimentos. Este nível de detecção não é possível quando se utiliza o método de contagem em placas. Para expressar o resultado, é necessário o auxílio de uma tabela de número mais provável. Na Figura 7 está mostrado uma tabela de número mais provável para alimentos. Figura 7 Tabela de Número mais Provável.

22 Executando a análise conforme a Figura 7, os limites mínimo e máximo de detecção do ensaio é <3,0 e >1100NMP/g ou ml, respectivamente. Há como diminuir e aumentar o limite de detecção do teste. Para diminuir, é necessário inocular 1mL de diretamente do alimento (alimentos líquidos) ou 10mL da diluição 10-1 (alimentos sólidos). Neste último caso, é necessário preparar a primeira série de tubos com dupla concentração e contendo exatamente 10mL. Este procedimento tem como objetivo evitar a diluição da amostra, visto que os 10mL de meio em dupla concentração, será diluído com 10mL de líquido da primeira diluição. Desta forma, a concentração final será a concentração recomendada pelo fabricante. Para aumentar o nível de detecção do teste, basta acrescentar mais tubos de diluição e diluir mais a amostra. Na Figura 8 e 9 estão mostrados como proceder para diminuir e aumentar o nível de detecção do ensaio, respectivamente. Figura 8 Técnica de tubos múltiplos com limite de detecção reduzido.

23 Figura 9 Técnica de tubos múltiplos com limite de detecção aumentado. Cálculo e expressão dos resultados - TABELA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL 1 Anotar o número de tubos positivos em cada diluição; 2 A quantidade de tubos positivos deve ser arranjados em uma única linha da maior para a menor diluição: Exemplo: Neste caso, a combinação de tubos a ser considerada é: Encontrar a combinação na Tabela de NMP. Exemplo: Número Mais Provável por grama ou ml, para séries de 3 tubos com inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou ml e respectivos intervalos de confiança 95%. Número de Tubos Positivos NMP/g ou ml Intervalo de Confiança (95%) Inferior Superior <3, , , > Observar se a diluição utilizada para obter a combinação coincide com a diluição da Tabela NMP. 5 Se coincidir, o NMP expresso na quarta coluna da Tabela NMP já é o resultado. Caso contrário, o resultado da quarta coluna deve ser multiplicado pela razão (divisão) entre a diluição mais concentrada inoculada e a primeira diluição da Tabela NMP.

24 Cálculo e expressão dos resultados - TABELA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL ELETRÔNICA Disponível no site: Download link: Item Tabela NMP-g ou ml. Série de 3 tubos. Inóculo 0,1; 0,01 e 0,001 g. Valença, 1ª Ed exe Tabela NMP-100 ml - Série de 10 tubos - Inóculo de 10 ml.valença, 1ª Ed exe Tabela NMP-100 ml - Série de 5 tubos - Inóculo de 10; 1; 0,1 ml.valença, 1ª Ed exe Tabela NMP-100 ml - Série de 5 tubos - Inóculo de 10 ml.valença, 1ª Ed exe Neste caso, deve-se digitar a combinação de tubos positivos após teste de confirmação em caldo verde brilhante ou Escherichia coli, e o resultado é gerado automaticamente. Também é necessário fazer a correção se a diluição mais concentrada utilizada para gerar o resultado não coincidir com a primeira diluição da Tabela NMP. Exemplo:

25 MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO É um método indireto de contagem microbiana baseado na propriedade de turvação do meio de cultura quando há crescimento microbiano. O nível de turvação do meio de cultura é medido em um espectrofotômetro e expresso como absorvância ou transmitância. Para medida do crescimento microbiano, é necessário utilizar um tubo contendo o mesmo meio de cultura de crescimento, porém sem inóculo. Este tubo será utilizado para zerar o equipamento e descontar a quantidade de luz que o meio sem crescimento microbiano absorve. Desta forma, a diferença de luz absorvida entre o tubo com crescimento e sem crescimento, é a quantidade de crescimento microbiano. A expressão do resultado pode ser em unidade de absorvância ou transmitância, porém pode-se expressar o resultado como UFC/g ou ml através da confecção de uma curva de calibração. Neste caso, é necessário obter uma quantidade considerável de amostra (normalmente por centrifugação e eliminação do sobrenadante), seguido de diluição em vários níveis de forma a contemplar toda faixa de extensão da leitura do espectrofotômetro (absorvância 0,2 0,8). O monocromador do equipamento deve estar ajustado para 620 λ. Construção da curva de calibração 1 Passo ativação do inóculo 2 Passo centrifugação, lavagem do pellet com tampão fosfato ph 7,2 e centrifugação. Este procedimento deve ser repetido duas vezes e tem como objetivo eliminar interferentes na leitura no espectrofotômetro; 3 Passo adicionar quantidade suficiente de tampão ao pellet de modo a conferir absorbância de 0,800 à 600λ; 4 Passo a partir do tubo ajustado no 3 passo, preparar mais quatro diluições transferindo os respectivos volumes de alíquota e tampão: 1:1; 1:5; 1:9; 1:99; 5 Passo ler e anotar a absorvância de todos os tubos no espectrofotômetro ajustado para 600 λ; 6 Passo fazer a contagem de UFC/g ou ml por alguma técnica de contagem (profundidade, superfície ou microgota); 7 Passo plotar um gráfico de dispersão absorvância x UFC/g ou ml. Solicitar regressão linear para avaliar a melhor equação representativa dos dados experimentais. Avaliar o valor de R e R 2.

26 Absorvância 600λ Cálculo de UFC/g ou ml de uma amostra 1 Passo tomar uma amostra e mensurar a absorvância no mesmo comprimento de onda selecionado para construção da curva de calibração; 2 Passo se a absorvância estiver no intervalo entre 0,2 e 0,8, este valor já pode ser utilizado para cálculo de UFC/mL. Caso contrário, deve-se diluir ou concentrar a amostra até conseguir absorvância nesta faixa de linearidade; 3 Passo o valor da absorvância é o y da equação. O valor de x é a quantidade de UFC/g ou ml; 4 Passo se tiver sido necessário diluir a amostra. O valor de x (UFC/g ou ml) ainda deve ser multiplicado pelo fator de diluição. Exemplo curva de calibração de Saccharomyces cerevisiae Leitura das diluições Diluições Absorvância (600λ) leitura ajustada : : : : Contagem das células em câmara de Neubauer Absorvância 600λ células/ml Log células/ml Plotagem do gráfico Log células/ml

27 Absorvância 600λ Inserir linha de tendência e exibir equação Log células/ml Problema 1 descobrir a quantidade de células/ml de um crescimento overnight de Saccharomyces cerevisiae Absorvância da amostra => (suposição) Este valor é o y da função. Para descobrir a quantidade de células/ml basta substituir na equação y = x = x = x x = 5.74 log células/ml Resolvendo log de 5.74 x = 5.4x10 5 células/ml Problema 2 ajustar um inóculo de Saccharomyces cerevisiae para conter exatamente 2,5x10 5 células/ml Este é o valor x da equação, substituindo: Log de 2,5x10 5 é de 5.40, portanto: y = x y = (5.40) y = Ajustar a absorvância (600λ) do inóculo para Problema 3 descobrir a quantidade de células/ml de um crescimento overnight de Saccharomyces cerevisiae Absorvância da amostra => (suposição) Diluir a amostra até a faixa de leitura Diluindo a amostra na proporção de 1:3 Absorvância da amostra => y = x = x = x x = 5.92 log células/ml Resolvendo log de 5.74 x = 8.4x10 5 células/ml x 4 (fator de diluição) x = 3.3x10 6 células/ml

28 BIBLIOGRAFIA TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R; CASE, Christine L. Microbiologia. 10.ed. Porto Alegre: Artmed, c2012. xxviii, 934 p., il., color. ISBN (enc.). PELCZAR, Michael Joseph; CHAN, E. C. S.; KRIEG, Noel R. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2.ed. São Paulo: Pearson Education: Makron Books, v., il. (algumas color.), tabs. Inclui apêndice, glossário e índice. ISBN v (Broch.). BAM - BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL On Line. U.S. Food and Drug Administration. Departmente os Health and Human Services, NEDER, Rahme Nelly. Microbiologia : manual de laboratório. São Paulo: Nobel, [138], il. Bibliografia : p. [138]. ISBN (Broch.). MADIGAN, Michael T.; MARTINKO, John M.; PARKER, Jack. Microbiologia de Brock. 10. ed. São Paulo: Prentice Hall, p., il. Inclui bibliografia e índice. ISBN KRIEG, N. R. & HOLT, J. G. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9th ed. Vol 1,2,3,4 - Willians & Wilkins Inc. N. York DOWNES, F.P. & ITO, K. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Washington, D.C.: American Public Health Association (APHA), p.