HEMOCENTRO RP TÉCNICA

Transcrição

1 P.: 01/05 1. OBJETIVO Isolar linfócitos T e B para realização de prova cruzada. 2. APLICAÇÃO Aplica-se às amostras de sangue com heparina ou ACD de doadores candidatos a transplante renal. *1 3. RESPONSABILIDADES Assistentes, Técnicos, Aprimorandos, Bolsistas e Biologistas. *1 4. PRINCÍPIO Os linfócitos T não aderem à lã de náilon, enquanto os B ficam aderidos na mesma (devido a incubação a 37ºC), e só são liberados através de lavagens com solução de soro bovino fetal 5% e a 10% respectivamente. 5. REAGENTES/MATERIAIS Lã de nylon. NaCl 0,9% Azul de Trypan Soro Bovino Fetal Tubos 50ml e 15ml Tubo de hemólise 5ml Câmara de Neubauer Palitos (tipo churrasco) 6. EQUIPAMENTOS Centrifuga Microscópio Balança analítica Banho maria Negatoscópio 7. PREPARO DE REAGENTES E MATERIAIS

2 PARA PROVA CRUZADA P.: 02/ SBF 50% (Soro bovino fetal) 1ml de soro bovino fetal com 1ml de NaCl 0,9%. 7.2 Azul de Trypan 1:3 1ml de azul de trypan com 2ml de NaCl 0,9%. 7.3 Solução A (5%) Em um tubo plástico de 50ml colocar 2ml de soro bovino fetal puro e adicionar 38ml de NaCl. Fechar e homogeneizar. 7.4 Solução B (10%) Em um tubo plástico de 15ml colocar 1ml de soro bovino fetal puro e acrescentar 9ml de NaCl. 7.5 Lã de Nylon Pesar 0,15g de lã de nylon em balança analítica e colocar em um tubo de 15ml. Transferir 10ml da solução A, mantendo a lã imersa na solução. Colocar os tubos contendo a solução A, B e lã de nylon no banho maria à 37ºC por 30 minutos. 8. PROCEDIMENTOS 8.1 Colocar em um tubo de 50ml, 10ml de sangue com heparina. Acrescentar 10ml de NaCl 0,9%. Homogeneizar. 8.2 Em 2 tubos de 15ml colocar 4ml de ficoll gradiente Transferir cuidadosamente na parede de cada tubo 10ml de sangue diluído, mantendo o tubo de 15ml em um ângulo de aproximadamente 45º. 8.4 Cuidadosamente colocar na centrífuga a 600g por 20 minutos (sem freio e sem refrigeração). 8.5 Ao final da centrifugação será visualizado um anel de leucócitos que, por meio de uma pipeta plástica, cada anel será transferido para um tubo de 15ml e em seguida completado com NaCl 0,9%. Homogeneizar. 8.6 Centrifuga o tubo 600g por 10 minutos. 8.7 Desprezar o sobrenadante e ressuspender o botão de linfócitos com 1ml de soro bovino fetal 50%. 8.8 Em um tubo de hemólise de 5ml colocar 190µl de azul de trypan 1:3. Acrescentar 10 µl da suspensão de células em SBF 50% Homogeneizar. 8.9 Transferir aproximadamente 10 µl para a câmara de Neubauer e contar as células presentes nos campos marcados com um C, demonstrados na figura1.

3 P.: 03/05 Figura Calcular a concentração ideal (10 a 15x10 6 ) conforme a formula descrita abaixo: X 1 = Volume de NaCl a ser acrescentado na suspensão de células. Obs.: O volume adicionado para diluir a solução deve ser retirado, fixando o volume final em 1ml Após 30 minutos retirar a lã de nylon do banho maria Em um tubo identificado de 15ml furar o centro da tampa do tubo e passar um palito (palito de churrasco) Enrolar a lã de nylon no palito, formando um cotonete Gotejar a suspensão celular (10-15x10 6 ) no ápice da lã, girando-a lentamente Levar ao banho maria 37ºC por 30 minutos Identificar 2 tubos de 15ml para linfócito T e numerar como tubos LT1 e LT Identificar 1 tubo de 15 ml para linfócito B e numerar como tubo LB 8.18 Retirar a solução A, B e lã de nylon do banho maria Utilizando uma pipeta pasteur gotejar a solução A, lavando a lã nos tubos identificados 1 e 2 (linfócito T) até o final da solução Transferir a solução B no tubo onde estava a solução A. Desfazer o cotonete (lã). Abrir a lã na parede do tubo e utilizando uma pipeta pasteur lavar a lã com a solução B (aproximadamente 50 jatos). Desprezar a lã. Inverter a solução no tubo LB (linfócito B).

4 PARA PROVA CRUZADA P.: 04/ Centrifugar os tubos LT1, LT2 e LB 600g por 10 minutos. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o tubo LT1 e LT2 com 1ml de soro bovino fetal 50%. Ressuspender o tubo LB com 200 l de soro bovino fetal 50% Em 2 tubos (tubo T e tubo B) de hemólise de 5ml colocar 190µl de azul de trypan 1: Acrescentar 10 µl da suspensão de células T (tubo 1 ou 2) no tubo T. Homogeneizar Acrescentar 10 µl da suspensão de células B (tubo 3) no tubo B. Homogeneizar Transferir aproximadamente 10 µl para a câmara de Neubauer e contar as células presentes nos campos marcados com um C, para o tubo T e tubo B. demonstrados na figura1. 9. CÁLCULOS 9.1 Linfócitos T Concentração ideal: 3x X 1 = Volume de NaCl a ser acrescentado na suspensão de células. OBS.: Se a contagem total for menor que 30 (contagem total) misturar o tubo LT1 com tubo LT2, completar o volume com NaCl, homogeneizar e centrifugar 600g por 10 minutos. Ressuspender com 1ml de soro bovino fetal 50% e contar novamente. 9.2 Linfócitos B Concentração ideal: 2,5x X 1 x 200 = Volume de NaCl a ser acrescentado na suspensão de células. 10. DOCUMENTOS COMPLEMENTARES TEHLA 005

5 P.: 05/05 Aprovação Biologista Encarregada Médico Responsável Diretor Responsável Implementação Gestão da Qualidade