HEMOCENTRO RP TÉCNICA

Transcrição

1 P. 1/6 1. OBJETIVO Amplificar os genes HLA-A, B, C, DRB1, e DQA1/DQB1 para posterior identificação dos seus respectivos grupos alélicos. *1 2. APLICAÇÃO Aplica-se às amostras de DNA genômico de doadores e receptores de Medula Óssea e órgãos. 3. PRINCÍPIO Esta metodologia está baseada na tipificação HLA por sondas de oligonucleotídeos seqüência específicas (SSO) aderidas em microesferas codificadas por fluorescência. O DNA alvo é amplificado por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) e então hibridizado com múltiplas sondas. 4. RESPONSABILIDADE Assistentes, Técnicos, Aprimorandos e Bolsistas. *1 5. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Kit de amplificação, composto de: D-mix e primers específicos para cada lócus. *1 *6 Termociclador 6. PROCEDIMENTOS 6.1 Ligar o termociclador para que este esteja estável no momento do uso. Conforme IOHLA001 e IOHLA003 *2 6.2 Retirar do freezer o tubo contendo D- mix, o primer a ser utilizado e as placas de PCR. *1 6.3 Conferir as amostras de DNA com a ATV 5434 mapa de trabalho de HLA ou Mapa de trabalho HLA - Contingência. *5 6.4 Preencher a ATV 5434 mapa de trabalho HLA. *5 6.5 Calcular as quantidades necessárias de D- mix, primers e Taq polimerase conforme a quantidade de amostras de DNA a serem amplificadas, de acordo com a tabela abaixo: Número de amostras D-mix Primers (em μ l) Taq (em μ l) 1 6,9 2,0 0,1 6.6 Dividir as placas de acordo com a quantidade de lócus. *1 *3 *6 6.7 Homogeneizar, com auxílio de agitador tipo vortex, as amostras de DNA. 6.8 Dispensar com auxílio de uma pipeta, 1,0 a 2,0 μ l de DNA e no controle negativo 1,0 μ l de água ultrapura. *1 *3 *4 6.9 Acrescentar 8,49 μ l da mistura de D-mix, primers e Taq. Agitar em vortex de placa. * Colocar a placa no termociclador, selecionando o programa 36 de amplificação. Conforme IOHLA Após o término da amplificação, abrir o termociclador e retirar a placa.

2 P. 2/ Fechar o termociclador e desligá-lo Correr gel de agarose para confirmar o resultado da amplificação conforme TEHLA 03. * Armazenar a placa contendo os fragmentos de DNA amplificado a 20ºC ou temperatura inferior. *1 OBS 1 Identificação e solução de problemas Para evitar a evaporação de amostras no termociclador deve-se observar se a placa está vedada completamente. OBS 2 Locus DR e DQ de doador de medula aparentado só serão realizados em caso de compatibilidade nos locus A e B. *3 *1 OBS 3 A amplificação do locus C só será realizada mediante solicitação do Redome/Rereme. *1 OBS 4 Casos de Tipificação HLA-DRB1 de alta resolução/definição mediante solicitação do Redome / Rereme utilizar primer XRDRB1. *1 *6 7. DOCUMENTOS COMPLEMENTARES IOHLA 001. IOHLA 003. *2 TEHLA 003 *5 8. REGISTROS DA QUALIDADE Mapa de Trabalho de HLA - Contingência. (Anexo I) *5 Controle de Mapa de Trabalho de HLA. (Anexo II) ATV 5434 mapa de trabalho HLA. *5

3 P. 3/6 Aprovação Biologista Encarregada Médico Responsável Diretor Presidente Executivo Implementação Gestão da Qualidade

4 P. 4/6 ANEXO I *1 *2 *5

5 P. 5/6 ANEXO I (Continuação) *1 *2 *5

6 P. 6/6 ANEXO II