VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE GENITORES PARA O MAPEAMENTO MOLECULAR DO ALGODOEIRO

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1 VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE GENITORES PARA O MAPEAMENTO MOLECULAR DO ALGODOEIRO Jair Moisés de Sousa (UFRN / jair.moises@hotmail.com), Ivandilson P. Pinto de Meneze (UFRN), Milena Ferreira Alves (UFRN), Lúcia Vieira Hoffmann(Embrapa Algodão), Paulo Augusto Viana Barroso (Embrapa Algodão) RESUMO A doença azul causa perdas significativas e o uso de defensivos agrícolas acarreta a diminuição da produtividade e o encarecimento do produto, principalmente nas regiões Sudeste e Centro-Oeste do Brasil. Objetivou-se verificar as diferenças genéticas entre as variedades de algodão Coodetec 401 e CNPA 6M e contribuir para o mapeamento molecular associado à doença azul, utilizando marcadores microssatélites (SSR). Verificou-se que nos primers selecionados cerca de 7,1% produziram bandas pouco definidas, 10,7% não produziram bandas, 50% apresentaram bandas monomórficas e 32,2% foram polimórficos. Portanto, foram identificados polimorfismos entre as variedades de algodão Coodetec 401 e CNPA 6M, que poderão ser utilizadas para gerar mapas genéticos. Palavras-chave: algodão, marcadores SSR. INTRODUÇÃO Construir um mapa genético envolve: i) encontrar grupos de genes e marcadores ligados, constituindo grupos de ligação; ii) medir a distância genética entre estes genes e marcadores, dada pela porcentagem de gametas recombinantes. Um mapa genético pode auxiliar na localização de genes ainda não mapeados, já que fornece a distribuição genômica dos marcadores. Um trabalho preliminar à produção do mapa é a escolha dos progenitores a serem utilizados. Os progenitores devem ser os mais divergentes possíveis para possibilitar a análise de um grande número de marcadores segregantes na população. Em muitos casos, para explorar ao máximo a divergência, o mapa é obtido a partir de um cruzamento entre uma espécie cultivada e uma espécie selvagem, sendo, portanto, um mapa interespecífico. A meta principal deste trabalho foi avaliar a variabilidade genética entre as variedades de algodão CNPA 6M (sensível à doença azul) e COODETEC 401 (resistente à doença azul), visando contribuir para o mapeamento molecular de resistência a doença azul do algodoeiro, possibilitando aos melhoristas a realização de seleção assistida e a capacidade da selecionar com mais eficiência as variedades propícias ao cultivo em regiões afetadas. Para tal fim, foi utilizado marcadores microssatélites ou Seqüências Simples Repetidas (Simple Sequence Repeats, SSR) o qual segundo Ferreira e Grattapaglia (1998), é de fácil execução e são ainda ideais no estudo de identificação e discriminação de genótipos, no estudo de genética de populações bem como no mapeamento genético e físico de genomas.

2 MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas dez amostras de DNA previamente extraídas das variedades CNPA 6M e COODETEC 401 as quais foram extraídas de acordo com o protocolo descrito por Ferreira e Grattapaglia (1998). Alíquotas do volume total do DNA extraído foram quantificadas por comparação visual da intensidade da fluorescência das bandas geradas de uma série de concentrações conhecidas de DNA fago λ (50, 100, 200 e 300 ng) em géis de agarose a 0,8% utilizando cuba de eletroforese horizontal. Posteriormente o DNA foi diluído a 10 ng/µl para as reações de SSR e selecionados 28 primers CIRAD observando sua distribuição ao longo dos cromossomos de acordo com Nguyen et al. (2004). Marcadores microssatélites foram obtidos a partir de 20 ng de DNA genômico de cada um dos genótipos de algodão em tampão 10 mm de Tris-HCl (ph 8,3), 50 mm de KCl, 2 mm de MgCl2, 0,2 mm de dntp, 0,6 unidade de Taq DNA polimerase e 0,4 mm de cada par de primer. Para amplificação dos fragmentos em PCR utilizou-se um termociclador que inicialmente desnaturou o DNA a 94 ºC por 5 minutos, seguido de 35 ciclos com a temperatura de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, temperatura de anelamento de acordo com cada primer descrito por Nguyen et. al. (2004) por 1 minuto e extensão a 72ºC por 1 minuto. Seguiu-se extensão final a 72 C por 8 minutos. Após a reação foram adicionados 10 µl de solução contendo 0,05% de azul de bromofenol, 0,05% de xyleno cianol, EDTA 10 mm e formamida 95%. Os produtos de amplificação foram desnaturados a 95ºC por 5 minutos no termociclador. Os fragmentos amplificados foram separados em eletroforese vertical em gel de poliacrilamida 6%, corados conforme Creste et. al. (2001). Os géis foram analisados de acordo com a visualização das bandas conferidas por seqüências de DNAs, a partir da mobilidade dos fragmentos produzidos durante a corrida no gel de poliacrilamida. A mobilidade das bandas, tanto do marcador molecular como de cada banda de amplificação de microssatélite, foi medida com régua. As medidas fornecidas para o marcador de peso molecular, juntamente com o peso molecular conhecido de cada banda, foram utilizados para uma análise de regressão, cuja fórmula foi utilizada para cálculo dos pesos moleculares das bandas dos microsatélites amplificados, a partir da mobilidade medida no gel. RESULTADOS E DISCUSSÃO A análise dos géis foi feita baseada na presença das bandas indicativas no gel de poliacrilamida, em comparação com a migração dos marcadores de peso molecular e com dados do peso molecular dos produtos de amplificação publicados (NGUYEN et al., 2004). Os resultados obtidos estão descritos na Tabela 1. Logo, dos 28 primers selecionados para este trabalho apenas os primers CIRAD 180, CIRAD 227 e CIRAD 340 não amplificaram bandas no gel de poliacrilamida, perfazendo cerca de 10,7% do total de primers selecionados.

3 Tabela 1. Resultado final da análise dos géis. Primer Migração (cm) nº de pares de bases Polimórfico coodetec 401 CNPA 6M esperados calculados CIR030 13,0 13, Não CIR032 1=11,9 1=11, /200 Não 2=11,8 2=11,8 201/201 CIR038 18,6 18, Não CIR039 17,1 17,1, Não CIR042 23,4 23, Não CIR047 26,0 26, Não CIR099 bandas pouco definidas CIR102 1=17,6 1=17, /155 Não 2=17,3 2=17,3 158/158 CIR104 17,0 17, Não CIR107 21,2 21, Não CIR109 1=13,6 1=13, /162 Sim 2=13,0 2=13,0 164/164 CIR121 bandas pouco definidas CIR122 17,3 17, /137 Sim CIR143 1=24,2 1=24, /112 Não 2=24,0 2=24,0 113/113 CIR159 1=16,0 1=15, /157 Sim 2=15,3 2=15,3 163/163 CIR175 21,7 21, Não CIR180 não amplificou CIR194 1=17,1 1=17, /144 Sim 2=16,5 2=16,3 150/152 CIR216 20,2 19, Sim CIR218 1=14,2 1=14, /177 não 2=13,9 2=13,9 181/181 CIR227 não amplificou CIR228 1=12,5 1=12, /202 não 2=11,7 2=11,7 216/216 CIR340 não amplificou CIR246 16,3 16, /148 sim CIR283 1=9,2 1=9, /275 sim 2=9,1 2=9,0 278/281 CIR286 1=11,0 1=11, /230 sim 2=11,2 2=10,9 226/233 CIR293 9,8 9, não CIR381 1=10,1 2=9,4 1=8,4 2=10, / /246 sim Uma possível causa desse fenômeno pode está relacionado a um não-anelamento desses primers durante a reação de PCR, uma vez que outros primers produziram bandas no mesmo gel e

4 utilizando os mesmos reagentes. Esse possível não-anelamento poderia ser ocasionado por mutações no sitio de ligação dos primers, como também outros processos que formam mutações tais como deleções e inserções. Os DNAs amplificados pelos primers CIRAD 099 e CIRAD 121 produziram bandas pouco definidas apresentando-se como manchas os quais perfizeram cerca de 7,1% dos primers selecionados. A reação de PCR para estes primers foi repetida duas outras vezes e o resultado foi sempre o mesmo, bandas pouco definidas. Por conseguinte, uma provável hipótese para tal fato pode ser explicada pelo anelamento pouco eficiente dos primers, visto que as quantidades dos reagentes foram as mesmas para todos os primers deste trabalho. Os primers CIRAD 030, CIRAD 032, CIRAD 038, CIRAD 039, CIRAD 042, CIRAD 047, CIRAD 102, CIRAD 104, CIRAD 107, CIRAD 143, CIRAD 175, CIRAD 218, CIRAD 228 e CIRAD 293 apresentaram bandas monomórficas com cerca de 50% do total de primers analisados. Entretanto, os primers CIRAD 109, CIRAD 122, CIRAD 159, CIRAD 194, CIRAD 216, CIRAD 246, CIRAD 183, CIRAD186 e CIRAD 381 apresentaram-se polimórficos perfazendo cerca de 32,2 dos primers selecionados. A diferença genética entre as variedades seria relativamente grande, pois a CNPA 6M é uma variedade de algodão mocó, G. hirsutum var. marie galante, enquanto a variedade COODETC 401 é de algodoeiro herbáceo, G. hirsutum var. hirsutum. A variabilidade entre estas variedades tinha sido estimada em 15,8% por RAPD (HOFFMANN et al., 2005), e a maior diversidade encontrada com marcadores microssatélite pode ser atribuída ao maior conteúdo de informação de polimorfismo (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). Os primers polimórficos aqui encontrados podem ser utilizados para mapeamento molecular de população derivada do cruzamento entre estas variedades, polimórficas para diversas características, dentre as quais resistência à doença azul, bem como para o estudo de fluxo gênico entre as duas variedades. CONCLUSÃO Foram identificados marcadores microssatélites polimórficos entre as variedades de algodão, que poderão ser utilizadas para gerar mapas genéticos, bem como marcadores moleculares que futuramente podem ser utilizados em algodão. CONTRIBUIÇÃO PRÁTICA E CIENTÍFICA DO TRABALHO Este trabalho identificou marcadores polimórficos entre o algodoeiro herbáceo e mocó. Esta informação pode ser incorporada a outras e utilizada para mapeamento molecular em cruzamentos envolvendo esses genótipos, bem como estudos de diversidade genética. Mapas moleculares que localizem características de interesse, como resistência a doenças, podem ser bastante úteis para servir como ferramenta do melhoramento genético. A seleção assistida por marcadores começa a poder ser pensada, e no caso de resistência a doenças ela é fundamental, pois muitas doenças, como a doença azul, não ocorrem de maneira uniforme no campo, e têm sua inoculação muito difícil, comprometendo a eficiência do melhoramento. A seleção assistida possibilitará, se viabilizada, a obtenção de genótipos resistentes de maneira mais eficiente ou em período menor.

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CRESTE, S.,TULMANN NETO, A., FIGUEIRA, A. Detection of single sequence repeat polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining. Plant Molecular Biology Reporter, v.19,, p , 2001 FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em Análise Genética. 3 ed. Brasília: Embrapa - Cenargen,, p. HOFFMANN, L.V.; ANDRADE, A. M. de; BATISTA, C. E. de A.; PEREIRA, F. R. A.; JÁCOME, R. G.; BARROSO, P. A.o V.. Distância genética entre algumas variedades brasileiras de algodão medida por marcadores RAPDs. Campina Grande: Embrapa Algodão, (Comunicado Técnico, 254). NGUYEN, T. B.; GINBAND, M.; BROTTIER, P.; RISTERUCCI, A. M. e LACAPE, J. M. Wide coverage of the tetraploid cotton genome using newly developed microsatellite markers. Theoretical and Applied Genetics, n. 109, p , 2004.