Amplificação, Detecção e Quantificação. Daniela Cochicho Luís Martins

Tamanho: px

Começar a partir da página:

Download "Amplificação, Detecção e Quantificação. Daniela Cochicho Luís Martins"

Pedro Lucas Pinto Rodrigues
5 Há anos
Visualizações:

1 Amplificação, Detecção e Quantificação PCR em Tempo Real Daniela Cochicho Luís Martins I curso de Virologia Molecular em Oncologia

2 PCR Clássico The polymerase chain reaction (PCR) is one of the most powerful technologies in molecular biology Sistema aberto Sequências de DNA ou de cdna especificas dentro de um modelo podem ser copiadas, ou "ampliadas", A Detecção e quantificação do produto amplificado realiza se no final da reacção, após o último ciclo de PCR A análise é realizada pela interpretação do tamanho de fragmentos em de gel de agarose 2

3 PCR Clássico Teoricamente, A reacção de PCR amplificaodna de forma exponencial, duplicando o número de moléculas presentes em cada ciclo de amplificação. O número de ciclos e a quantidade do produto final de PCR pode ser utilizada para calcular a quantidade inicial de material genético (por comparação com um padrão conhecido). mas inúmeros factores complicam este cálculo Nos primeiros ciclos de amplificação, a reacção não está na sua fase exponencial. O que origina erros associados a amplificações inespecíficas que podem interferir no resultado final Assim, para uma análise mais precisa, da quantidade de DNA, esta deve ser medida no mesmo tempo que a reacção está ainda em fase exponencial de amplificação. 3

4 PCR Tempo Real Para lidar com estas adversidades, foi desenvolvida a tecnologia de PCR em tempo real. Sistema fechado Sequências de DNA ou de cdna especificas dentro de um modelo são copiadas, ou "ampliadas" A utilização de marcadores fluorescentes, que são incorporados no produto de PCR A quantidade de produto de PCR é medida em cada ciclo 4

5 PCR clássico vs PCR Tempo Real Detecção e quantificação do produto formado 5

6 PCR Tempo Real Detecção e quantificação de fluorescência Flo ouorescênc cia Fase Exponencial Patamar Nº de Ciclos 6

7 Representação Gráfica Gáfi PCR 7

8 PCR Tempo Real Detecção e quantificação de fluorescência Como é dt determinada d a Quantidade d do DNA? Estabelecimento de uma baseline Análise do Background Estabelecimento de um Threshold O ciclo ao qual este Threshold é ultrapassado Threshold Log (Fluorescê ência) Fluorescência Background Fase Exponencial Nº de Ciclos Cycle Threshold (Ct): ciclo em que a amostra cruza o Threshold. 8

9 PCR em Tempo Real Várias metodologias PCR em Tempo Real: Corantes fluorescences: Detecção inespecífica SYBR Green Sonda: Detecção específica Sondas TaqMan (Hidrólise) Molecular Beacons Sondas de Hibridização (Light Cycler) Sondas MGB Sondas LNA 9

10 Metodologias em PCR Tempo Real 10

11 PCR em Tempo Real SYBR Green: Liga se no minor groove do DNA em cadeia dupla e a fluorescência aumenta após esta ligação. Durante a extensão, o SYBR Green continua a ligar se ao DNA de cadeia dupla que se forma por acção da Taq Polimerase. Em cada ciclo de amplificação, o sinal de fluorescência aumenta proporcionalmente ao DNA produzido 11

12 PCR em Tempo Real Em PCR Tempo Real pode associar se a Curva de Dissociação (Melting Curve): Após amplificação (40 a 50 ciclos), os fragmenos de DNA são aquecidos até à temperatura de 95º o que promove a sua desnaturação Ocorre diminuição de Fluorescência (libertação SYBR Green) Definição de Temperatura de dissociação: É atingida quando temos 50% do DNA em cadeia simples e 50% em cadeia dupla. Esta é especifica de cada fragmento que pretendemos amplificar: Tamanho do fragmento Quantidade de GC existentes 12

13 Curva de Dissociaçãoi Visualização gráfica da Curva Dissociação: Aquecimento lento entre 60 e 95ºC Dissociação da Cadeia dupla diminui a fluorescência 13

14 PCR em Tempo Real Vantagens e desvantagens Ligação inespecífica podeconstituir uma desvantagem Requer bastante uma optimização das condições do ensaio Podemos usar este tipo química quando: Não há necessidade da especificidade conferida pela Sondas Para ensaios de screening, acoplados a ensaios Taqman ou de Sondas de Hibridação Não usar em: Ensaios de descriminação de alelos Reacções Multiplex (nem sempre!) Detecção de patogeneos com baixo nº de cópias 14

15 PCR em Tempo Real Sondas alguns conceitos: Fluoroforo: molécula queemite emite luz a um dado comprimento de onda depois de absorver luz noutro comprimento de onda Quencher: molécula que aceita energia de um fluoroforo na forma de luz e dissipa a energia sob a forma de luz ou de calor FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer 15

16 PCR em Tempo Real Sondas de Hidrólise: TaqMan Após ligação dos primers e da Sonda à cadeia complementar, a actividade exonuclease da Taq Polimerase degrada a Sonda ligada a cadeia DNA Temos uma Sonda com dois fluorofuros: Quencher (extremidade 3 ) Reporter (extremidade 5 ) 16

17 Sonda Taqman 17

18 PCR em Tempo Real Sondas de Hidrólise: TaqMan Devido à proximidade dos dois fluoroforos, não há emissão de fluorescência (FRET) A degradação da Sonda leva a libertação do Fluoroforo Reporter (extremidade 5 ) Uma vez liberto o Reporter, não há transferência de energia (FRET) entre este e o Quencher O Fluoroforo Reporter, por acção de uma fonte de luz (Laser, LED ou Lâmpada), passa a emitir fluorescência num dado comprimento de onda 18

19 PCR em Tempo Real Dyes Nome Comercial Excitação Emissão 6 carboxyfluorescein 6 FAM 494 nm 518 nm 2,4,1,4 tetrachlorofluorescein TET 521 nm 536 nm 2,4,5,7,1,4 14 hexachlorofluorescein HEX 535 nm 556 nm 2,7 dimethoxy 4,5 dichloro 6 carboxyrhodamine JOE 520 nm 548 nm 2 chloro 5 fluoro 7,8 fused phenyl 1,4 dichloro 6 carboxyfluorescein NED 576 nm 2 chloro 7 phenyl 1,4 dichloro 6 carboxyfluorescein VIC 538 nm 554 nm 6 carboxytetramethylrhodamine TAMRA 565 nm 580 nm 6 carboxy N,N,N,N tetramethylrhoramine ROX 580 nm 605 nm (4 (4' dimethylaminophenylazo)benzoic acid) succinimidyl ester Dabcyl NFQ Black Hole 1 NFQ Black Hole 2 NFQ 19

20 PCR em Tempo Real 20

21 Primers em Reacções TaqMan: PCR em Tempo Real Têm de ter Tm entre 58 60ºC Tamanho entre bases Conteúdo de G+C à volta de 30 80% Não ter quatro ou mais G s seguidos Não ter mais do que dois G+C na extremidade 3 Não ter nenhum G na extremidade 5 (pref. Aou C) O tamanho do fragmento a amplificar deve ter entre bp (max 400) 21

22 PCR em Tempo Real Molecular Beacons Sondas Hibridização 22

23 PCR em Tempo Real Aplicações PCR em Tempo Real: PCR Quantitativo: Quantificação Absoluta: Exemplo: Carga Viral Quantificação Relativa: Expressão génica PCR Qualitativo: Discriminação Alelica Presença/ Ausência de DNA 23

24 24

Documentos relacionados

PCR em Tempo Real / PCR quantitativa (qpcr)

PCR em Tempo Real / PCR quantitativa (qpcr) em Tempo Real / quantitativa (q) Dra. Elisabet Marti Serrano emartiserrano@gmail.com (Polymerase Chain Reaction) Amplificação in vitro de uma sequência específica de DNA - Primers o iniciadores - DNA polimerase