Aluna: Carina de Mattos Soares Orientadora: Dra Cídia Vasconcellos Supervisora: Dra Vânia Lucia Ribeiro da Matta

Transcrição

1 Comparação da eficácia da PCR convencional e em tempo real na identificação de espécies de Leishmania sp do Novo Mundo, usando diferentes alvos moleculares luna: Carina de Mattos Soares Orientadora: Dra Cídia Vasconcellos Supervisora: Dra Vânia Lucia Ribeiro da Matta Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo Laboratório de Patologia e Moléstias Infecciosas (LIM5)

2 s leishmanioses são doenças causadas pelo protozoário do gênero Leishmania que é transmitido ao homem através da picada de insetos flebotomíneos. Espécie do parasito Leishmaniose cutânea Leishmaniose mucosa Leishmaniose visceral

3 reação em cadeia da polimerase (PCR) vem sendo empregada cada vez mais no diagnóstico das leishmanioses, devido a sua alta sensibilidade e especificidade (Reithinger; Dujardin, 27). lém do diagnóstico, outra possível aplicação da PCR refere-se à identificação da espécie do parasito diretamente na amostra clínica. Importância identificação das espécies: nos estudos epidemiológicos, no direcionamento do tratamento e no prognóstico do paciente eficiência da PCR, convencional ou em tempo real, na discriminação das espécies do parasito depende do alvo (sequencia de nucleotídeos do DN do parasito) a ser amplificado in vitro. escolha dos primers (oligonucleotídeos iniciadores) é de fundamental importância, pois são eles que vão flanquear e determinar a sequencia do DN do parasito que será amplificada. P R I M E R S mplificação exponencial

4 OBJETIVO Comparar a eficácia das reações de PCR convencional e em tempo real na identificação de espécies de Leishmania sp do Novo Mundo, empregando diferentes pares de primers MTERIIS E MÉTODOS Primers RV1/RV2 (alvo: kdn) Lima Junior et al. Rev Soc Bras Med Trop. 29; 42(3):33-8. HSP7c (alvo: gene da proteína de choque térmico de 7 kda) LU5/LC3L; LU5/LM3; LU5/LB3C (alvo:gene que codifica o RN spliced leader -SL). Harris et al. J Clin Microbiol.1998;36(7): Graça et al. Mem Inst Oswaldo Cruz. 212;17(5):

5 MTERIIS E MÉTODOS Leishmania (Leishmania) infantum chagasi (MHOM/ BR/72/LD46); (MHOM/BR/1974/PP75); (MHOM/BR/22/LPC-RPV) Leishmania (Leishmania) amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269); (IFL/BR/1967/PH8) Leishmania (Viannia) braziliensis (MHOM/BR/1975/M293/566) ; (MHOM/BR/1995/M1528); (M15323) Leishmania (Viannia) lainsoni (MHOM/BR/1981/M6426); (M123) Leishmania (Viannia) shawi (MCEB/BR/1984/M848);(M1973) Leishmania (Viannia) naiffi Concentração DN utilizada na PCR para todas as espécies: 1 ng/µl (MDS/BR/1979/M5533); (MDS/BR/1979/M5633) Leishmania (Viannia) lindenberg (M15733) Leishmania (Viannia) guyanensis (MHOM/BR/1975/M4147) ; (MHOM/BR/1975/M293/565) Trypanosoma cruzi e Plasmodium malariae

6 MTERIIS E MÉTODOS Para realizar a PCR convencional utilizamos um termociclador, e para visualização da amplificação é necessária a confecção de um gel de agarose e a realização de uma eletroforese para separação dos fragmentos de DN amplificados. visualização destes fragmentos é feita através da exposição do gel à luz ultravioleta. Pente Poço Gel Tampão Fonte C U B 1 V do DN

7 MTERIIS E MÉTODOS digestão com enzimas de restrição do produto amplificado gera fragmentos de diferentes tamanhos (padrões de restrição) que podem diferenciar as espécies de Leishmania sp Hae III

8 MTERIIS E MÉTODOS PCR em tempo real (qpcr) dispensa o uso do gel de agarose e da eletroforese para visualizar o resultado da amplificação. Revela o produto amplificado por fluorescência Sybr Green - Fluoresce quando ligada ao DN dupla-fita - Cada ciclo, mais sinal fluorescente é detectado

9 RESULTDOS

10 Fluorescence (norm) PCR convencional RV1/RV2 (L. (L.) i. chagasi) PCR em tempo real PM La Lb Lb Ln Ln Ls Lg Lla Lli Tc Lc Lc CN B Lc La Lb/Tc Pm Cycle Threshold: Baseline settings: 342 (Noiseband) automatic, Drift correction OFF PCR convencional: possível diferenciar L. (L.) i. chagasi das outras 7 espécies de Leishmania sp. qpcr : amplificação de todas as espécies analisadas. Foi possível diferenciar L. (L.) i. chagasi através da temperatura de melting (Tm).

11 Fluorescence (norm) PCR convencional LU5/LC-3L (L. (L.) i. chagasi) PCR em tempo real PM Lc Lc Lb Lb La La Ln Ln Ls Ls Lg Lg Lla Lla Lli Tc CN B Lc Lb La Cycle Threshold: 342 (Noiseband) Baseline settings: automatic, Drift correction OFF PCR convencional: não houve amplificação de L. (L.) i. chagasi, e de nenhuma outra espécie de Leishmania sp analisada e de T. cruzi. qpcr : houve amplificação das três espécies analisadas. Foi possível a diferenciação de L. (L.) i. chagasi através da Tm.

12 Fluorescence (norm) PCR convencional LU5/LM-3 (L. (L.) amazonensis) PCR em tempo real PM Lc Lc Lb Lb La La Ln Ln Ls Ls Lg Lg Lla Lla Lli Tc CN B Lb/Lc La Cycle Threshold: Baseline settings: 833 (Noiseband) automatic, Drift correction OFF PCR convencional: não houve amplificação de L. (L.) amazonensis. qpcr : houve amplificação das três espécies analisadas e além disso, foi possível a diferenciação das três espécies testadas através da Tm.

13 Fluorescence (norm) PCR convencional PM Lc Lc La La Lb Lb Ln Ln Ls Lg Lg Lla Lla Lli Tc CN LU5/LB-3C (L. (V) braziliensis) B PCR em tempo real Lb La Lc Cycle Threshold: Baseline settings: 342 (Noiseband) automatic, Drift correction OFF PCR convencional: amplificação somente das espécies de Leishmania sp pertencentes ao subgênero Viannia. qpcr : houve amplificação das três espécies analisadas. Diferenciação de L. (L.) amazonensis e L.(V.) braziliensis x L.(L.)i. chagasi pela Tm.

14 Fluorescence (norm) PCR convencional PM Lc Lc Lc Lb Lb Lb La La Ln Ln Ls Ls HSP7c (todas as espécies de Leishmania sp) Lg Lg Lla Lla Lli Tc Pm CN B PCR em tempo real Lc/Lb La Cycle Threshold: 1668 (Noiseband) Baseline settings: automatic, Drift correction OFF PCR convencional: amplificação de todas as espécies de Leishmania sp e não houve amplificação de T. cruzi e P. malariae. qpcr: houve amplificação das três espécies analisadas, porém não foi possível discriminar nenhuma das espécies pela pela Tm.

15 HSP7c Perfis de bandas após digestão com Hae III Subgênero Viannia PM Lc Lc Lc Lb Lb Lb La La PM Ln Ln Ls Ls Lg Lg Lla Lla Lli Perfil 1 Perfil 3 Perfil 2 Perfil 2 B Digestão com Hae III possível diferenciar as 3 espécies mais prevalentes no Brasil. subgênero Viannia: foram observados três padrões de restrição perfil 1: L. (V.) braziliensis e L. (V.) naiffi; perfil 2: L. (V.) shawi, L. (V.) lainsoni e L. (V.) lindenberg; perfil 3: L. (V.) guyanensis.

16 CONCLUSÕES

17 PCR convencional RV1/RV2 Especifico para L. (L.) i. chagasi. PCR tempo real PCR convencional mplifica L. (L.) i. chagasi, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis. Discrimina apenas L. (L.) i. chagasi. LU5/LB-3C Específico para o subgênero Viannia de Leishmania sp. PCR tempo real LU5/LC-3L PCR convencional Não amplificou Leishmania sp. PCR tempo real mplifica L. (L.) i. chagasi, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis. Discrimina apenas L. (L.) i. chagasi. mplifica L. (L.) i. chagasi, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis. Discrimina apenas L. (L.) i. chagasi.

18 PCR convencional Não amplificou Leishmania sp. LU5/LM-3 PCR tempo real mplifica L. (L.) i. chagasi, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis. Discrimina todas elas. PCR convencional HSP7c mplifica todas as 8 espécies (gênero específica) Hae III: diferenciação entre (L.) i. chagasi, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis e várias do subgênero Viannia PCR tempo real mplifica L. (L.) i. chagasi, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis Não há como diferenciar essas espécies

19 CONCLUSÃO Dada a importância da identificação das espécies nos estudos epidemiológicos, no direcionamento do tratamento e no prognóstico do paciente, acreditamos que o presente estudo traga elementos contribuidores para tal identificação Muito obrigada