VI Simpósio Estadual de Hepatites Virais B e C

Transcrição

1 BIOLOGIA MOLECULAR DOS VÍRUS DAS HEPATITES B E C Dra REGINA CÉLIA MOREIRA Pesquisadora Científica - Instituto Adolfo Lutz SP [email protected] VI Simpósio Estadual de Hepatites Virais B e C

2 VÍRUS DA HEPATITE B AgHBe

3 Replicação HBV

4 Genoma HBV

5 2300 Genoma HBV 1650 Polimerase Pré- S/ S Pré-Core/ Core 1370 X X / VHB- DNA P1 582 P184 RHBS2 P2 565 M2 P197 5 LAM5 5LAM5 2920R M1 P194

6 HBV Mt Mutações de resistência itê i Proteina terminal Spacer Pol/RT RNaseH (rt1) (rt 344) GVGLSPFLLA YMDD 845 a.a. I(G) II(F) A B C D E LAM/ FTC V173L L180M M204I/V ADV A181V N236T I233V? M204I/V ETV I169T T184G S202G/I M250V LdT TDF A194T? M204I 1. Allen et al. Hepatology 1998; 2. Gish et al. J Hepatol 2005; 3. Qi et al. J Hepatol 2004; 4. Tenney et al. AAC 2004; 5. Lai et al. Gastroenterology 2005; 6. Sheldon et al. Antivir Ther 2005; 7. Delaney et al. AAC 2006 ; 8. Schildgen et al NEJM 2006 ; 9. Curtis et al JID 2007.

7 SEQÜENCIAMENTO DO GENE DA DNA POLIMERASE DO VHB L180M M204 V207L Domínio B Domínio C

8 Diversidade Viral Subtipos: definidos por anticorpos monoclonais dirigidos contra epitopos específicos do HBsAg Não refletem a variabilidade genética Genótipo baseado na divergência na seqüência de nucleotídeos do genoma viral. São diferentes populações virais que resultam de alterações no genoma que ocorrem de forma randomica.

9 CARGA VIRAL PARA HBV Anti-HBc Isolado Mutantes virais com modificações antigênicas ou baixa produção de HBsAg Mutações Pré-core Mutantes virais que não produzem HBeAg (HBsAg (+) HBeAg (-) anti-hbe (+) ) Resistência aos Anti-virais Lamivudina

10 CARGA VIRAL PARA HBV PORTARIA MINISTERIAL Portaria no de 28 de outubro de 2009 Atualização do protocolo clínico e diretrizes terapêuticas da Hepatite Viral B, estabelecendo novos critérios de diagnóstico e tratamento

11 CARGA VIRAL PARA HBV - PORTARIA MINISTERIAL Monitoramento de pacientes: HBeAg reagente, com ausência de cirrose; HBeAg não reagente, com ausência de cirrose; com cirrose com HBeAg reagentes e não reagentes; Hepatite viral crônica em crianças; Coinfecção do vírus HBV e HDV; Coinfecção HBV e HIV; Coinfecção HBV e HCV.

12 Métodos de amplificação Vírus, bactérias ou células PCR DNA alvo primers & enzimas Cópias (DNA) bdna Adicionar i probes e branched DNA

13 Biologia Molecular para o HBV Testes Utilizados 1. Carga Viral Kits comerciais Amplicor HBV (Roche) 60UI/mL UI/mL bdna (Siemens) 100UI/mL linearidade de 357 a 1,78 X10 7 UI/mL Real Time PCR (COBAS Ampliprep/ COBAS Taqman HBV Test- Roche) -12UI/mL linearidade de 54,5 a 1,1 X10 8 UI/mL

14 REAL TIME PCR Real-time PCR monitora a fluorescência emitida durante a reação como um indicador da produção de amplificado em cada ciclo de PCR

15 PCR- Reação da Polimerase em Cadeia Seqüência alvo de RNA Biotina cdna

16 PCR- Reação da Polimerase em Cadeia Seqüência alvo de RNA cdna

17 PCR- Reação da Polimerase em Cadeia Biotina Pi Primer rthdna Polimerase cdna

18 REAL TIME PCR

19 REAL TIME PCR

20 A série com cinco diluições da amostra aparenta chegar ao plateau no mesmo lugar mesmo a fae exponencial A série com cinco diluições da amostra aparenta chegar ao plateau no mesmo lugar, mesmo a fae exponencial claramente mostrar uma diferença entre os pontos através da série de diluições. Isso demonstra o fato de que se as medidas fossem tiradas na fase de plateau, os dados não representariam as quantidades iniciais de material alvo

21 Vantagens do Real-time PCR * Não influenciado por amplificação não específica * A amplificação pode ser monitorada em tempo real * Não ocorre processamento pós-pcr (baixo risco de contaminação) * Ciclagem ultra-rápida (30 minutos a 2 horas) * Requer 1000x menos RNA/DNA que os ensaios convencionais *confirmação da amplificação específica em tempo real * Mais específico, sensível e reprodutivo

22 Desvantagens do Real-time PCR * A padronização requer alto treinamento técnico Alto custo do equipamento * * * * Variação intra- e inter-ensaio * Labilidade do RNA * Contaminação por DNA (na análise de mrna)

23

24 BIOLOGIA MOLECULAR - HEPATITE C Vírus da hepatite C

25 Journal of General Virology (2000), 81,

26 GENÓTIPOS Trabalhos demonstram a existência i de 11 genótipos (WHO, 2009) 6 genótipos distintos (1,2,3...) Subtipos (a,b,c...)

27 IMPORTÂNCIA DOS GENÓTIPOS HCV Estudos epidemiológicos Distribuição geográfica Determinar a droga e o tempo do tratamento t t

28 GENOTIPAGEM Técnicas Utilizadas LIPA Sequenciamento ****** Definição da Droga para Tratamento Duração do Tratamento

29 REPRESENTAÇÃO DA TÉCNICA DE Line Probe Assay (LIPA ) Cromógeno (NBT/BCIP) Precipitado roxo 5 Fosfatase alcalina Avidina Biotina Fragmento amplificado Sonda de DNA 3 Membrana de Nitrocelulose

30 BIOLOGIA MOLECULAR HEPATITE C Hepatite C Genotipagem INNO - LIPA HCV Linha de marcação Conjunto de controle Controle de amplificação 1 1a 1b 2 2a 2b a 2b 3a 2

31 LIPA VANTAGENS Possível identificação de tipos e subtipos virais Kits comerciais disponíveis Fácil execução e interpretação Possibilidade de identificação de co-infecção DESVANTAGENS Custo Não detecta mutações pontuais

32 SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO - RESULTADO

33 SEQUENCIAMENTO VANTAGENS Caracterização do genótipo baseada diretamente da seqüência de nucleotideos Possibilidade de realizar análises filogenéticas de cepas isoladas Detecção de mutações pontuais, assim como identificação de possíveis deleções

34 SEQUENCIAMENTO DESVANTAGENS Equipamento caro Profissionais altamente capacitados Aquisição de programas compatíveis para análise das seqüências

35 Métodos de amplificação Vírus, bactérias ou células RNA alvo TMA primers & enzimas Cópias (RNA) PCR primers & enzimas Cópias (DNA) bdna Adicionar i probes e branched DNA

36 BIOLOGIA MOLECULAR - HEPATITE C Hepatite C - Testes moleculares Detecção do HCV-RNA Maior sensibilidade e especificidade Detecção simultânea de diferentes vírus (HCV/HIV) Maior automação, menor tempo de reação Maior eficiência em amostra de pools NAT Stramer SL Transfus Med. 2002

37 BIOLOGIA MOLECULAR - HEPATITE C Hepatite C - Testes moleculares Detecção do HCV-RNA TMA (amplificação mediada transcrição) isotérmica alta sensibilidade alto grau de automação tempo de reação curto detecção simultânea

38 BIOLOGIA MOLECULAR - HEPATITE C HCV-RNA - Detecção PCR in house PCR semi-automatizado TMA

39 BIOLOGIA MOLECULAR - HEPATITE C Hepatite C - Diagnóstico QUANTIFICAÇÃO DO HCV-RNA Avaliação de resposta ao tratamento

40 BIOLOGIA MOLECULAR HEPATITE C Hepatite C Carga viral b-dna 2.0 b-dna 3.0 PCR semi-automatizado PCR automatizado PCR Tempo real Kleiber J, J. Clin Virol, 2001 Germer JJ Arch pathol Lab Med, 2002 Nolt FS Rinsho Byori, 2001