Marcadores Moleculares

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO AF 6- Biotecnologia Vegetal Marcadores Moleculares Prof a. Renata Faier Calegario

2 INTRODUÇÃO Marcadores Características que permitem a distinção de indivíduos geneticamente diferentes Morfológicas, Bioquímicas ou Moleculares (BORÉM, 997).

3 Aplicações: diversas áreas do conhecimento Melhoramento Genética mendeliana Genética de populações Marcadores Genéticos Genética molecular Organização do genoma Sequenciamento Transferência gênica

4 Fenótipo Características visíveis de um indivíduo Sofre influência: ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Genótipo Fatores ambientais Genótipo Constituição genética de um organismo => o conjunto de genes

5 ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Haplóide: Constituído por uma cópia de cada cromossomo Diplóide: Constituído por duas cópias de cada cromossomo Alelo: Genes que ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos Local ocupado pelo gene no cromossomo Haplóide Diplóide

6 ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Homozigotos: Célula diplóide com alelos idênticos de um gene em ambos os cromossomos homólogos Heterozigotos: Célula diplóide com alelos diferentes de um gene em ambos os cromossomos homólogos

7 DOMINÂNCIA Gene Recessivo Só manifesta o fenótipo quando em homozigose (aa) Presente em dose dupla (dois alelos iguais) Gene Dominante Manifesta o mesmo fenótipo em homozigose (AA) e heterozigose (Aa)

8 MARCADORES DOMINANTES A A A A 2 A 2 A 2 Mesmo padrão de bandas: Homozigose e Heterozigose => exclusão de um dos alelos na expressão gênica do heterozigoto

9 MARCADORES DOMINANTES Resultados são codificados matriz de dados binários (presença/ausência) L L2 L3 L4 L5 L6 L7 L Ind. L L2 L3 L4 L5 L6 L7 L Interpretada por análise estatística e softwares (Genes, Statistica, etc) Gera índices de similaridade e distância genética

10 MARCADORES CO-DOMINANTES A A A A 2 A 2 A 2 Genes no mesmo locus Padrão de bandas diferentes: Homozigose e Heterozigose => Expressão de ambos os alelos no heterozigoto

11 MARCADORES CO-DOMINANTES Resultados são codificados matriz de coincidência alélica Ind Linha /3 3/4 2/3 3/3 /3 / /3 /4 3/3 /2 Interpretada por análise estatística e softwares (Genes, Statistica, etc) Gera índices de similaridade e distância genética

12 TIPOS DE MARCADORES Marcadores Morfológicos Características fenotípicas do organismo Ex. Nanismo, deficiência de clorofila, cor de pétala ou morfologia foliar Marcadores Bioquímicos Presença ou ausência de compostos Ex. isoenzimas e proteínas Marcadores Moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA Ex. alteração em bases nitrogenadas - Várias técnicas

13 CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE UM MARCADOR Reprodutibilidade Amplamente distribuído através do genoma Poder de discriminação Ausência de influências ambientais Barato Fácil de mensurar

14 MARCADORES MOLECULARES Vantagens Não sofre influência do ambiente Neutros em relação a efeitos fenotípicos N ilimitado de marcadores e de polimorfismo Desvantagens Necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos

15 TÉCNICAS E FERRAMENTAS DE BIOMOL Levou à descrição de várias classes de marcadores moleculares Eletroforese Eletroforese Enzimas de restrição Restrição PCR Termociclador PCR

16 CLASSES DE MARCADORES MOLECULARES A partir Varia de acordo com a técnica RFLP Restrição e Hibridização de sequências DNA RAPD, Microssatélites PCR AFLP PCR + restrição

17 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfirmo no tamanho de fragmentos de restrição Utiliza o DNA genômico digerido com enzima de restrição Examina diferenças no tamanho de fragmentos de restrição de DNA Polimorfismo: resultado de mutação pontual, inserção, deleção Requer conhecimento sequência

18 RFLP Hibridização Southern Blot

19 RFLP - METODOLOGIA. DNA tratado com enzimas de restrição = Gera fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos: Eletroforese 3. Transferência para a membrana e Hibridização com sonda 4. Visualização dos fragmentos na membrana sondas marcadas ( 32 P) ou Fluorescência 5. Análise dos resultados presença/ausência de bandas diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas A escolha de sonda/enzima de restrição = direcionada

20 ANÁLISE DOS RESULTADOS

21 Homozigotos para alelos A - (3, 5, 6, 7, 8, 9) Homozigotos para os alelos A2 - (, 2,4)

22 RFLP: Identificação de Fitoplasma em Tomate + T + T + T + T + T + T Fragmentos que hibridizarem com a sonda + Grupo 6 SrIII Fonte: Mello et al., 27.

23 RFLP Vantagens Reprodutível Marcadores co-dominantes Simples Desvantagens Trabalhoso Caro Uso de sondas radioativas

24 RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA Fragmentos de DNA amplificados por PCR Método mais rápido para detecção de polimorfismos DNA genômico amplificado por PCR Uso de um único primer aleatório (8- bases): função de R e F Marcador dominante

25 RAPD - METODOLOGIA. DNA é amplificado via PCR com primer aleatório = Gera fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos por eletroforese 5. Análise dos resultados presença/ausência de bandas diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas

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27 RAPD - METODOLOGIA A B A B

28 PRIMERS ALEATÓRIOS DNA Primer se anela em vários pontos do DNA (desconhecidos) Quando se anela em direções opostas = Amplificação Anelamento em pequenas distâncias Vários Fragmentos

29 RAPD - Feijoeiro Fonte: Moura, 25 Não Resistentes à raça 65 marcador ligado à Co- Ausência banda 53pb = Resistentes Co- = gene que confere resistência à raça 65 de C. lindemuthianum

30 RAPD Vantagens Rápido e simples - não envolve hibridização Baixo custo Sem uso de radioisótopos Não precisa conhecimento prévio da sequência de DNA Desvantagens Marcador dominante Problemas de reprodutibilidade: produtos amplificados não são conhecidos Problemas de interpretação: co-migração - mesma banda: mesmo fragmento? Pode ser outro! - uma banda: um fragmento? Pode ser dois! Fonte: IPGRI

31 MICROSSATÉLITES Pequenas sequências com a 4 nucleotídeos, repetidas em tandem (em sequência) Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC Dinucleotídeos Trinucleotídeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC Amplificadas por PCR Marcador Co-dominante Maior grau de polimorfismo Requer conhecimento prévio da sequência

32 MICROSSATÉLITES: METODOLOGIA. Digestão DNA Enzimas de Restrição 2. Seleção dos Fragmentos (tamanho) e clonagem em vetor 3. Transformação da bactéria e seleção das colônias por hibridização (sondas com sequências repetidas) 4. Sequenciamento dos clones 5. Desenho dos primers

33 MICROSSATÉLITES cada ilha microssatélite constitui um locus, multialélico Cada fragmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo locus

34 DETECÇÃO DE LOCUS SSR Simple Sequence Repeats = Microssatélites (CA) 3 CACACA GTGTGT CACACA GTGTGT (CA) 3 Amostra Amostra 2 Amostra 3

35 MICROSSATÉLITES Marcador multialélico Alelos diferentes da mesma repetição (mesmo locus) Marcador Molecular com maior conteúdo de informação de polimorfismo

36 MICROSSATÉLITES Marcador Co-dominante M homozigoto heterozigoto Gel de poliacrilamida ou agarose de alta resolução Perceber diferenças de nucleotídeos

37 MICROSSATÉLITES Vantagens Reprodutibilidade Requer pequena quantidade de DNA Baixo custo Grande poder de resolução Alto nível polimorfismo útil para germoplasmas aparentados e de baixa variabilidade Desvantagens Necessidade de serem desenvolvidos para cada espécie (sem primers aleatórios) Trabalhoso Porém: uma vez desenvolvido é fácil Caro

38 Atributos Isoenzimas Proteínas de sementes RFLPs RAPDs Microssatélites AFLPs Nível de baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto Polimorfismo Estabilidade moderada alta alta alta alta alta ambiental Número de locos moderado (<5) baixo (<) alto alto alto alto Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante Número de alelos por 2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2 loco Distribuição no regiões de cópia regiões de cópia várias ao acaso ao acaso ao acaso genoma única única Acessibilidade muito alta muito alta média muito alta muito baixa média tecnológica Aplicabilidade no melhoramento rápido, baixo custo rápido, baixo custo lento, custo médio rápido, baixo custo lento, custo alto rápido, custo baixo Identificação de baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta genótipos Avaliação de média baixa alta alta alta muito alta germoplasma Mapeamento baixa muito baixa alta alta muito alta alta genético Mapeamento de baixa inadequado média muito alta média muito alta regiões específicas Mapeamento baixa inadequado muito alta baixa alta baixa comparativo Genética de baixa baixa média alta muito alta muito alta Autógamas Genética de média baixa média alta muito alta muito alta Alógamas Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média Adaptado de Gepts (993) e Ferreira & Grattapaglia (995).

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40 Fingerprints = impressões digitais de DNA => perfis genéticos únicos de elevada precisão e reprodutibilidade

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43 APLICAÇÕES Diversidade genética de organismos Proteção de cultivares - demonstrar que a cultivar é diferente de qualquer outra variedade da mesma espécie Análise da pureza genética de semente Mapeamento de genes e características (associação do marcador com os genes de interesse) Impressão digital do DNA identificação de padrão único de combinação alélica (identificação de cultivares e organismos) Seleção de genitores Retrocruzamento assistido...

44 BIBLIOGRAFIA. Aluízio Borém e Eveline Teixeira Caixeta - Marcadores Moleculares Viçosa, MG, Fábio Gelape Faleiro - Marcadores Genético-Moleculares aplicados a programas de conservação e uso de recursos genéticos. EMBRAPA Cerrados, Planaltina, DF, Luciano Arruda Ribas Variabilidade isoenzimática e sistema de cruzamento de Parapiptadenia rigida em um pomar de sementes. Tese de mestrado, UFV,