Diagnóstico molecular das Hepatites

Transcrição

1 Diagnóstico molecular das Hepatites B e C : novos algoritmos Dra REGINA CÉLIA MOREIRA Pesquisadora Científica VI - Instituto Adolfo Lutz SP [email protected]

2 Vírus da hepatite B Partícula viral me 42 nm; Envelope HBsAg; proteína L e M Core ou nucleocapsío HBcAg; HBeAg Genoma DNA Dupla fita incompleta DNA polimerase

3 HBV Mutações resistência Proteina terminal Spacer Pol/RT RNaseH (rt1) (rt 344) GVGLSPFLLA YMDD 845 a.a. I(G) II(F) A B C D E LAM/ FTC V173L L180M M204I/V ADV A181V N236T I233V? M204I/V ETV I169T T184G S202G/I M250V LdT TDF A194T? M204I 1. Allen et al. Hepatology 1998; 2. Gish et al. J Hepatol 2005; 3. Qi et al. J Hepatol 2004; 4. Tenney et al. AAC 2004; 5. Lai et al. Gastroenterology 2005; 6. Sheldon et al. Antivir Ther 2005; 7. Delaney et al. AAC 2006 ; 8. Schildgen et al NEJM 2006 ; 9. Curtis et al JID 2007.

4 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL 1. Pesquisa dos marcadores sorológicos - Ensaio Imunoenzimático 2. Teste Biologia Molecular (HBV DNA quantitativo Carga Viral)

5 Marcadores Sorológicos HBsAg Anti-HBc Anti-HBc IgM Anti-HBs HBeAg Anti-HBe

6 HEPATITE B BIOLOGIA MOLECULAR Anti-HBc Isolado Mutantes virais com modificações antigênicas ou baixa produção HBsAg Mutações Pré-core Mutantes virais que não produzem HBeAg (HBsAg (+) HBeAg (-) anti-hbe (+) ) Protocolo tratamento pacientes com HBeAg (-) e carga viral > cópias/ml Resistência aos Anti-virais Lamivudina (YMDD)

7 CARGA VIRAL PARA HBV - PORTARIA MINISTERIAL MINISTERIAL (Portaria no outubro 2009) Monitoramento pacientes: HBeAg reagente, com ausência cirrose; HBeAg não reagente, com ausência cirrose; com cirrose com HBeAg reagentes e não reagentes; Hepatite viral crônica em crianças; Coinfecção do vírus HBV e HDV; Coinfecção HBV e HIV; Coinfecção HBV e HCV.

8 PCR- Reação da Polimerase em Caia 1 ciclo = 1(RNA/cDNA hibrido) 2 ciclos = 2 Amplificações 3 ciclos = 4 Amplificações 4 ciclos = 8 Amplificações 5 ciclos = 16 Amplificações 6 ciclos = 32 Amplificações 7 ciclos = 64 Amplificações

9 PCR EM TEMPO REAL Real-time PCR monitora a fluorescência emitida durante a reação como um indicador da produção amplificado em cada ciclo PCR

10 REAL TIME PCR

11 Vantagens do Real-time PCR * Não influenciado por amplificação não específica * A amplificação po ser monitorada em tempo real * Não ocorre processamento pós-pcr (baixo risco contaminação) * Ciclagem ultra-rápida (30 minutos a 2 horas) * Mais específico, sensível e reprodutivo

12 REAL TIME PCR - COBAS Ampliprep

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14 HEPATITE B BIOLOGIA MOLECULAR Kits disponíveis e registrados na ANVISA para o diagnóstico COBAS AMPLICOR MONITOR LINEARIDADE 60UI/mL a UI/mL COBAS TAQMAN HBV - LINEARIDADE 20UI/mL a UI/mL

15 INSTRUÇÕES PARA COLETA DA BIOLOGIA MOLECULAR - HEPATITE B (HBV) TESTE PCR quantitativo para Hepatite B (Carga viral) COLETA Colher 2 tubos com EDTA 5mLou 7mL cada (Tampa roxa) ou um tubo 9mL seco com gel separador TAMPA AMARELA Anotar na ficha solicitação DATA, HORA e RESPONSÁVEL pela coleta

16 Caso o tubo seja o TAMPA AMARELA: Homogeneizar por inversão Deixar em repouso à temperatura ambiente por 30min. Centrifugar a rpm/15min. A amostra verá chegar ao laboratório executor em, no máximo, 20 horas após a coleta, mantendo refrigerado. NÃO CONGELAR PREENCHIMENTO DAS FICHAS (OBRIGATÓRIO) TODOS os dados do paciente CNS, data nascimento Não abreviar nome do paciente DATA, HORA e RESPONSÁVEL pela coleta. Nome, CRM e assinatura do médico solicitante.

17 Presinte Prunte Araçatuba São José do Rio Preto Marília Assis Bauru Barretos Araraquara Botucatu Franca Rib Preto Piracicaba São João da Boa Vista Campinas REDE DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA HEPATITE B Taubaté Franco da Rocha Osasco Capital Moji das Cruzes Sorocaba Registro Metropolitana São Paulo Santos São José dos Campos Metropolitana São Paulo Santo André IAL Central IAL São José Rio Preto UNESP Botucatu UNICAMP HC-USP Ribeirão Preto Lab Suste (Pref São Paulo)

18 O vírus da hepatite C Envelope Core Glicoproteínas do Envelope RNA Viral (9400 nt) nm

19 Métodos Moleculares estrutural Proteínas Nucleocapsío Glicoproteínas do envelope Protease Helicase não estrutural RNA polimerase RNA pennte C E1 E2 NS2 NS3 NS4 NS5 hipervariáveliá NCR- 5 NCR- 3 Diagnóstico Molecular e Genotipagem Genotipagem

20 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Métodos indiretos - Pesquisa anticorpos ELISA - 3ª geração/4ª geração Immunoblot - 3ª geração/4ª geração Métodos diretos - Pesquisa componentes virais RNA viral

21 TESTES DE BIOLOGIA MOLECULAR HEPATITE C HCV-RNA diagnóstico viremia monitoramento resposta ao tratamento avaliação resposta sustentada diagnóstico precoce infecção transmissão materno-fetal diagnóstico g infecção em imunossuprimidos pré-tratamento fator preditivo tratamento

22 TESTES DE BIOLOGIA MOLECULAR HEPATITE C 1. HCV-RNA Qualitativo 2. HCV-RNA Quantitativo 3. Genotipagem

23 IMPORTÂNCIA DOS GENÓTIPOS HCV 6 genótipos distintos (1,2,3...) Subtipos (a,b,c...) Estudos epimiológicos Distribuição geográfica Determinar a droga e o tempo do tratamento

24 Hepatite C - Testes moleculares GENOTIPAGEM Técnicas Utilizadas LIPA Sequenciamento Real Time

25 Hepatite C - Testes moleculares Hepatite C Genotipagem INNO - LIPA HCV Linha marcação Conjunto controle Controle amplificação 1 1a 1b 2 2a 2b a 2b 3a 2

26 SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO - RESULTADO

27 PCR em Tempo Real kit ABBOTT HCV real time genotype II Adição sondas oligonucleotíos específicos marcados Detecta t os genótipos 1a e 1b Genótipos 2,3,4,5,e 6

28 Comparação dos Métodos Moleculares Diagnóstico das Hepatites Virais b-dna 2.0 b-dna 3.0 PCR semi-automatizado PCR automatizado PCR Tempo real

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31 HEPATITE C BIOLOGIA MOLECULAR Kits disponíveis e registrados na ANVISA para o diagnóstico ABBOTT REAL TIME HCV - LINEARIDADE 12UI/mL a UI/mL (0,5mL amostra)

32 INSTRUÇÕES PARA COLETA DA BIOLOGIA MOLECULAR - HEPATITE C (HCV) TESTE - PCR Quantitativo para o HCV - Genotipagem para o HCV - PCR Qualitativo para o HCV COLETA Colher 9 ml sangue por punção venosa em tubo com gel (ou dois 5mL ou 7mL) seco com gel separador TAMPA AMARELA

33 INSTRUÇÕES PARA COLETA DA BIOLOGIA MOLECULAR - HEPATITE C (HCV) Homogeneizar por inversão Deixar em repouso à temperatura ambiente por 30min. Centrifugar a rpm/15min. A amostra verá chegar ao laboratório executor em, no máximo, 4 horas após a coleta, mantendo refrigerado. NÃO CONGELAR PREENCHIMENTO DAS FICHAS (OBRIGATÓRIO) TODOS os dados d do paciente CNS, data nascimento Não abreviar nome do paciente Nome, CRM e assinatura do médico solicitante.

34 Biologia Molecular Anti-HCV + ALT / Biópsia Teste qualitativo DIAGNÓSTICO PRÉ-TRATAMENTO Genotipagem Teste quantitativo (genótipo 1) TRATAMENTO 12a semana (gen 1) Teste quantitativo Final tratamento Teste qualitativo Resposta Sustentada Teste qualitativo

35 MINISTÉRIO DA SAÚDE SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE DEPARTAMENTO DE DST, AIDS E HEPATITES VIRAIS PROTOCOLO CLÍNICO E DIRETRIZES TERAPÊUTICAS PARA HEPATITE VIRAL C E COINFECÇÕES Julho/2011

36 INDICAÇÕES DE REALIZAÇÃO DE TESTES DE BIOLOGIA MOLECULAR Solicitação tratamento Para Hepatite C Virgem Tratamento Não Respondor Respondor com Recidiva Carga Viral Carga Viral Carga Viral Genotipagem Indicação tratamento triplo Genótipo 1 com F3 ou F4 Terapia Dupla PEG + RBV 8ª Semana Carga Viral Intectável Continua Terapia Dupla > 1 Log Incluir Boceprevir/Telaprevir < 1 Log Avaliação caso a caso 12ª Semana Carga Viral

37 REDE DE Presinte Prunte São José do Rio Preto Araçatuba Marília Assis Bauru Barretos Franca Rib Preto Araraquara Botucatu Piracicaba São João da Boa Vista Campinas DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA HEPATITE C até Taubaté 07/2011 Franco da Rocha Osasco Capital ABCD Mogi das Cruzes Sorocaba Registro Metropolitana São Paulo Santos São José dos Campos IAL Central IAL Sorocaba IAL São José Rio Preto IAL Presinte Prunte UNESP Botucatu Metropolitana CRT-AIDS UNESP Araraquara São Paulo Lab Central HC-FMUSP UNICAMP Inst Infectologia Emilio Ribas HC-USP Ribeirão Preto Hosp Israelita Albert Einstein Hosp Guilherme Álvaro

38 Equipe Núcleo Doenças Sanguineas e Sexuais Centro Virologia Instituto Adolfo Lutz Adriana Parise Compri - Biomédica, PqC I Angela Ferrari Auxiliar Laboratório Angela Maria Spina Biomédica, PqC IV Clóvis Roberto Abe Constantino ti Auxiliar laboratório Isabel Oba Farmacêutica, PqC IV Marcilio Figueiredo i Lemos Biomédico, PqCIII Maria Divina da Silva - Auxiliar laboratório Regina Célia Moreira - Biomédica, PqCVI Bolsista FUNDAP / FAPESP Karoline Rodrigues Campos- Biomédica Alunas Mestrado Ana Paula T Santos Biomédica Samira Julien Calux - Biomédica

39 O B R I G A D A! [email protected]