HEPATITE C PCR Qualitativo, Quantitativo e Genotipagem

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1 HEPATITE C PCR Qualitativo, Quantitativo e Genotipagem O Vírus da Hepatite C (HCV) é considerado o principal agente etiológico responsável por 90 a 95% dos casos de hepatite pós-transfusional não A e não B. Estima-se que existam no mundo 200 milhões de pessoas infectadas pelo HCV, e foi descrito como uma pandemia viral, com uma prevalência cinco vezes superior à da infecção por HIV. Grande parte destas pessoas é assintomática e sem conhecimento do estado de portador do vírus. O dado mais grave no entanto é que cerca de 99,99% destas pessoas teriam doença hepática, seja de caráter incipiente ou alguma forma mais agressiva. De acordo com dados da Secretaria da Saúde, estima-se que no Brasil exista cerca de 3 milhões de portadores. Em São Paulo, cerca de pessoas são portadores do vírus, sendo que apenas destes encontram-se em tratamento. O HCV é um vírus de RNA de cadeia simples, apresentando um genoma de aproximadamente nucleotídeos que codificam aminoácidos. Como vírus presente no sangue, o HCV pode ser transmitido através do sangue e de produtos derivados do sangue. A prevalência da infecção por HCV é elevada em pacientes receptores de transplantes de órgãos, de transfusões de sangue ou de fatores de coagulação comerciais, em pacientes com exposição percutânea por abuso de drogas por via intravenosa, e em pacientes submetidos à diálise renal. A persistência do RNA do HCV por mais de seis meses após a infecção caracteriza a infecção crônica por este vírus. É tema controverso a proporção de pessoas infectadas pelo HCV que desenvolve infecção crônica, mas calcula-se que esse valor em média deve ficar entre 70 a 80% dos infectados. Testes Sorológicos na lnfecção HCV A presença de anticorpos anti-hcv em pacientes infectados por este vírus deu origem ao desenvolvimento de testes imunosorológicos específicos para estes anticorpos. Testes adicionais suplementares como o RIBA (Recombinant ImmunoBlottAssay) têm sido efetuados, com o objetivo de avaliar, em maior profundidade, amostras que se apresentam repetidamente reativas no ensaio de rastreio de anticorpos. No entanto, um resultado sorológico positivo não constitui um verdadeiro indicador de infecção ativa por HCV, dado que os pacientes que se recuperam podem manter-se anti-hcv positivos durante anos. Além disso, o teste sorológico pode indicar uma infecção atual ou passada, mas não permite fazer uma discriminação entre os dois casos. Atualmente, não se encontram disponíveis comercialmente ensaios imunológicos para a detecção direta do antígeno do HCV ou métodos de cultura viral. A determinação de níveis de Alanina Aminotransferase (ALT) em conjunto com outros dados clínicos e laboratoriais, é considerado como indicador de infecção por HCV, mas não é uma determinação direta da viremia. O grau de elevação de ALT não pode ser diretamente correlacionado com o nível de infecção por HCV. Na realidade, o nível de ALT pode ser elevado devido a um certo número de causas de inflamação do fígado, incluindo entre outras a hepatite viral.

2 Testes Moleculares (PCR) na lnfecção HCV Os testes baseados em seqüência de ácidos nucléicos, também chamados testes por Biologia Molecular, possibilitaram grande avanço no diagnóstico da infecção por HCV assim como no seguimento destes pacientes. Sabe-se que o tempo médio para desenvolvimento de anticorpos após a infecção pelo vírus da Hepatite C é de 8 a 12 semanas. Durante este período, o paciente encontra-se em infecção aguda, geralmente com grande quantidade de vírus circulante, assintomático mas capaz de transmiti-lo. Os testes moleculares como a PCR (Polimerase Chain Reaction) possibilitam a detecção direta do RNA viral, sendo capaz de diagnosticar a infecção durante o período de janela imunológica. Este teste também é de grande utilidade na detecção do RNA do HIV em pacientes imunocomprometidos, já que é independente do estado imunológico do paciente. A detecção e quantificação do RNA do HCV por PCR oferecem uma medida de viremia ativa. Utilizando estes testes, é possível detectar viremia do HCV anterior à soroconversão imunológica, e detectar mudanças na carga viral em pacientes infectados sujeitos à terapia. A especificidade do teste molecular para o RNA do vírus da hepatite foi avaliada através da realização de testes para detectar uma possível reatividade cruzada com amostras comuns de hepatite viral não HCV (HBV e HAV). Estes testes foram negativos para HCV, mostrando que não são originados resultados falsos positivos com os outros vírus comuns da hepatite. Teste Qualitativo O teste qualitativo, por ser de maior sensibilidade quando comparado à Carga Viral (Teste Quantitativo), está indicado para o diagnóstico da infecção por HCV nos seguintes casos: Pacientes com sorologia positiva ou indeterminada; Pacientes com antecedentes de uso de drogas endovenosas; Profissionais de Saúde após exposição ocupacional; Crianças nascidas de mães HCV positivas; Pacientes que sofrem hemodiálise; Pacientes transfundidos antes de 1992; Pacientes com elevação persistente de ALT (Alanina Aminotransferase) acima de uma vez e meia o limite superior de referência nos últimos seis meses; Pacientes imunossuprimidos; Para avaliação da resposta à terapia e cura em casos de Carga Viral abaixo do limite de detecção. Limite de detecção O limite de detecção do teste qualitativo foi determinado pela menor concentração de HCV produzindo uma taxa de detecção positiva de 95% ou superior. Foi observado um limite de detecção de 50UI/mL ou 135 cópias/ml para o plasma.

3 Controle de Qualidade Em processos de amplificação baseados em enzimas, como é o caso da PCR, a eficiência da amplificação pode ser reduzida por inibidores que podem estar presentes na amostra clínica. Desta forma, em todos os testes qualitativos executados pelo SAE é adicionado o Controle Interno para permitir a identificação de amostras processadas contendo substâncias passíveis de interferir com a amplificação por PCR. Teste Quantitativo Carga Viral O Teste Quantitativo por PCR (Amplicor Monitor - Roche) é um teste de amplificação de ácidos nucléicos in vitro destinado à quantificação do RNA do Vírus da Hepatite C no plasma humano. Este teste destina-se a ser utilizado em conjunto com a apresentação clínica e com outros marcadores laboratoriais, como um meio de auxílio para avaliação da resposta viral à terapêutica antiviral, determinada através de alterações dos níveis de plasma de RNA do HCV. Este teste não se destina a ser utilizado como um teste diagnóstico visando confirmar a presença de infecção por HCV. Consensos atuais sugerem que o teste quantitativo possa ser útil na determinação da probabilidade de resposta a tratamento antiviral. A Declaração da Associação Européia para o Estudo do Fígado (2002) recomenda o teste quantitativo para HCV antes do tratamento e indica que pacientes que apresentam níveis mais elevados de viremia (cerca de 2 milhões de cópias/ml) são relativamente menos susceptíveis de responder à terapia. A declaração também sugere a utilização do níveis de RNA do HCV de pré-tratamento juntamente com a Genotipagem do HCV para determinara duração da terapia. Investigações recentes demonstraram que diminuições precoces (dentro de 2-12 semanas) dos níveis de RNA do HCV após o início do tratamento são altamente indicadores do resultado derradeiro da terapia. Existe uma probabilidade muito reduzida de pacientes que não apresentam diminuições precoces significativas responderem ao tratamento. Utilizando o PCR quantitativo para medir os níveis de RNA do HCV, estudos confirmam que uma diminuição inicial de pelo menos 2 log nesta concentração é um forte indicador de resposta virológica sustentada. Limite de detecção e linearidade do teste: O teste quantitativo apresentou limite de detecção de 600UI/mL ou 1620 cópias/ml. Por ser menos sensível que o teste qualitativo, este não deve ser utilizado como teste diagnóstico, e um resultado Abaixo do Limite de Detecção não exclui a possibilidade de exposição e infecção pelo HCV. A linearidade do teste é presente até UI/mL. Controle de Qualidade A quantificação do RNA viral do HCV é efetuada utilizando o Padrão de Quantificação do HCV. Este padrão encontra-se incorporado em cada amostra individual, sendo transportado através de todos os passos da PCR, em conjunto com o RNA viral alvo. Os níveis de RNA do HCV presentes são determinados comparando o sinal do HCV com o sinal do Padrão de Quantificação do HCV em cada amostra. Este

4 compensa os efeitos de inibição e controla o processo de amplificação, visando permitir uma quantificação rigorosa do HCV em cada amostra. Limitações O teste foi validado para utilização exclusiva com plasma humano colhidos com EDTA como anticoagulante. A utilização de outro tipo de amostra pode dar origem a resultados falso-negativos ou falso- positivos. A heparina inibe a PCR; não se devem usar amostras colhidas usando heparina como anticoagulante. A detecção do HCV depende do número de partículas do vírus presentes na amostra, e pode ser afetada por métodos de colheita, por fatores inerentes ao próprio paciente (idade, presença de sintomas) e/ou pelo estágio da infecção. O efeito de crioglobulinas sobre este teste não se encontra validado. Resultados de RNA do HCV negativos de amostras que apresentam comprovadamente níveis elevados de crioglobulinas devem ser interpretados com precaução. O efeito de fármacos para o tratamento de infecções bacterianas e fúngicas sobre este teste não se encontra determinado. Como qualquer teste diagnóstico, os resultados deverão ser interpretados tomando em consideração todos os achados clínicos e laboratoriais. Interferentes Hemólise pelo fato do HCV ser um vírus de RNA, este é facilmente degradável pela enzima RNAse, presente no interior das hemácias. A hemólise resulta na liberação destas enzimas, podendo diminuir a quantidade de RNA viral detectável. Bilirrubina algumas amostras com alto nível de bilirrubina apresentaram resultados falso-positivos. Fármacos como Interferon alfa-2b, Ribavirina e Zidovudina NÃO produziram quaisquer resultados falsos positivos ou falsos negativos. Portanto, os testes qualitativo e quantitativo podem ser utilizados em amostras de pacientes submetidos a tratamento com vários agentes terapêuticos para a infecção pelo HIV em co- infecções com HCV. Genotipagem do HCV O vírus da Hepatite C apresenta alto grau de heterogeneidade em suas seqüências nucleotídicas, gerando o aparecimento de diferentes genótipos. Baseado em estudos de sequenciamento genético, o HCV foi classificado em seis maiores genótipos e vários subtipos designados como: la, lb, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, 5 e 6. O genótipos mais comuns no Brasil são 1, 2 e 3. A utilidade clínica da Genotipagem do HCV consiste na determinação da epidemiologia da transmissão e predição da taxa de progressão da doença e resposta à terapia do paciente com infecção crômica. Portadores dos genótipos 2 ou 3 respondem melhor ao tratamento com interferon convencional, enquanto os pacientes portadores do genótipo 1, principalmente o 1b, apresentam pior resposta, devendo ser tratados com interferon peguilado.

5 E necessário carga viral superior a 600UI/mL para que este exame possa ser realizado. Amostras com quantidade inferiores à sensibilidade do teste podem não apresentar partículas virais suficientes para a amplificação e análise do gene do HCV e o resultado será liberado como indeterminado. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CDC, MMWR, VOL. 47, n RR-1 9. Gretch, D. et al. Viral Hepatitis Reviews 2: Consensus Statement. EASL International Consensus Conference on Hepatitis C. J Hepatol 1999; 31 Suppl 1:3-8 Young, K et al. Journal of Clinical Microbiology 31: Saldanha, J et al. Vox Sanguinis 76:

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