Elaborado por: Karina Salvador Revisado por: Hilda Helena Wolff Aprovado por: Andréa Cauduro

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1 ANTI- 1 Manual CAMBRIDGE BIOTECH -1 POP: BM 05 Página 1 de 7 1. Sinonímia ANTI, TESTE CONFIRMATÓRIO. 2. Aplicabilidade Aos bioquímicos e técnicos do setor de imunologia. 3. Aplicação clínica Os testes de triagem usados para detecção de anticorpos anti- apesar de ter alta sensibilidade, não são 100% específicos havendo a necessidade da realização de teste confirmatório mais específico nas amostras reagentes na etapa de triagem. O Western Blot Cambridge anti--1 é o teste confirmatório usado nos pacientes participantes do protocolo HPTN 052 e é um dos testes usados na etapa 2 do algoritmo definido na portaria nº 151 do MS de14 de outubro de Auxilia no diagnóstico da infecção causada pelo vírus da imunodeficiência humana (-1), retrovírus do grupo dos lentivírus e responsável pela síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), definida pelo desenvolvimento de infecções oportunistas e neoplasias, decorrentes da imunosupressão induzida pelo vírus. 4. Princípio do teste Proteínas antigênicas específicas -1 obtidas de vírus -1 inativados e purificados são fracionadas conforme seu peso molecular por eletroforese em gel de poliacrilamida e após transferidas e incorporadas à tiras de nitrocelulose, que é o suporte sólido da reação. Durante uma primeira incubação, anticorpos anti- presentes na amostra ligam-se às proteínas fixadas nas tiras, formando um complexo antígeno-anticorpo. Após a incubação as tiras são lavadas para remoção de material que não reagiu. Numa etapa posterior é adicionado anti-igg humano conjugado com biotina que se liga ao complexo antígeno-anticorpo. Após a incubação as tiras são lavadas para remoção de material que não reagiu. Na etapa seguinte é adicionada avidina conjugada com uma peroxidase (HRP). Numa etapa final é adicionado um substrato da HRP que ao se ligar a peroxidase torna visíveis as bandas em que houve a reação. 5. Amostra 5.1 Preparo do paciente Jejum não necessário

2 ANTI- 1 Manual CAMBRIDGE BIOTECH -1 POP: BM 05 Página 2 de Tipo de amostra Soro ou plasma. 5.3 Colheita Observar as precauções universais para punção venosa. Quantidade mínima de sangue: 1 ml Quantidade ideal de sangue: 1 ml 5.4 Preservação e transporte As amostras são estáveis por 14 dias refrigeradas a C. Para o transporte observar as normas de segurança legais. 5.5 Identificação da amostra Etiqueta com código de barras gerada pelo SIL. 5.6 Armazenamento Amostras estáveis por um ano quando congeladas a 20 0 C. Homogeneizar após o descongelamento e centrifugar a x g por 10 minutos. 5.7 Amostras inadequadas Amostras mal identificadas, muito lipêmicas, hemolisadas, com contaminação microbiana evidente não devem ser testadas. 6. Reagentes e materiais Reagentes do kit - 27 tiras de nitrocelulose incorporadas com proteínas antigênicas do Tampão Diluente de trabalho concentrado 10 x (Tampão TRIS com soro normal de cabra inativado). - Tampão de Lavagem: concentrado 20X. - Tampão de Trabalho Blotting: concentrado 10X. - Conjugado 1: anti-igg-humano de cabra conjugado biotina. - Conjugado 2: avidina conjugada a peroxidase HRP. - Substrato A: Solução de 4-cloro-1 naftol. - Substrato B: Solução de Hidrogênio Peroxidase - Leite em pó desnatado. - Placas de incubação com 9 canaletas de reação. - Tampas para as placas. Controles - 1 Controle Positivo Fraco: soro humano inativado com baixos títulos de anticorpos Anti Controle Positivo Forte: soro humano inativado com altos títulos de anticorpos Anti Controle Negativo: soro humano normal não reagente para anti Preparo

3 ANTI- 1 Manual CAMBRIDGE BIOTECH -1 POP: BM 05 Página 3 de 7 - Tampão de Lavagem: diluir uma parte do Tampão de Lavagem Concentrado em 19 partes de água destilada. - Tampão Diluente de Trabalho Blotting: Diluir 1 parte do Tampão Concentrado em 9 partes de água destilada. Adicionar 1 g de leite em pó desnatado para cada 20 ml do Tampão pronto para uso. Agitar. - Conjugado 1: Preparar imediatamente antes do uso. Diluir em Tampão Diluente Blotting pronto para uso na proporção indicada nas instruções suplementares que acompanham o kit. - Conjugado 2: Preparar imediatamente antes do uso.diluir em Tampão Diluente Blotting pronto para uso na proporção indicada nas instruções suplementares que acompanham o kit. - Solução de Substrato: Preparar imediatamente antes do uso. Misturar volumes iguais de substrato A e Substrato B. Misturar bem. Proteger da luz. Reagentes Requeridos por tira: Nº de tiras Tampão de Lavagem (ml) Leite em pó (g) 0,3 0,9 1,8 2,7 4,5 6,0 8,1 Tampão Blotting (ml) Conjugado 1 (ml) Conjugado 2 (ml) Substrato A (ml) Substrato B (ml) Estabilidade Tampão de Lavagem: a TA por até 3 meses. Tampão Diluente de Trabalho Blotting: a 2-8ºC até 5 dias. 6.3 Armazenamento Os reagentes devem ser armazenados a 2-8 C. Evitar a exposição das tiras e substrato à luz. O aparecimento de cor no Substrato A indica deterioração do reagente por oxidação e impede a sua utilização. 7. Equipamentos Centrífuga, pipetas automáticas, pinça, plataforma de agitação, bomba de lavagem a vácuo, geladeira. 8. Calibração Não se aplica. 9. Procedimento (passo a passo)

4 ANTI- 1 Manual CAMBRIDGE BIOTECH -1 POP: BM 05 Página 4 de 7 - Preparar os tampões de lavagem e blotting de trabalho. - Pipetar 2 ml de tampão de lavagem nas canaletas. - Usando uma pinça colocar as tiras nas canaletas de reação. Observar para que estejam bem cobertas pelo tampão de lavagem. - Anotar o nº da tira referente a cada amostra - Agitar 5 minutos T. A na plataforma de agitação. - Aspirar completamente o líquido com pipetas Pasteur descartáveis ou com auxílio de bomba de vácuo. Usar uma pipeta ou ponteira nova para cada canal. - Adicionar 2 ml de Tampão Blotting em cada canaleta. - Pipetar 30 µl da amostra e controles. - Incubar por 2 horas a TA sobre a plataforma de agitação. - Aspirar o líquido. - Lavar as tiras 3 vezes com Tampão de Lavagem: adicionar 2 ml em cada canaleta, agitar na plataforma por 5 minutos e aspirar o líquido trocando a ponteira em cada lavagem e em cada amostra. - Adicionar 2 ml do conjugado 1 recém preparado. - Incubar 60 minutos a TA sobre a plataforma de agitação - Aspirar o líquido. - Lavar as tiras 3 vezes com Tampão de Lavagem: adicionar 2 ml em cada canaleta, agitar na plataforma por 5 minutos e aspirar o líquido trocando a ponteira em cada lavagem e em cada amostra. - Adicionar 2 ml do conjugado 2 recém preparado. - Incubar 60 minutos a TA sobre a plataforma de agitação. - Aspirar o líquido. - Lavar as tiras 3 vezes com Tampão de Lavagem: adicionar 2 ml em cada canaleta, agitar na plataforma por 5 minutos e aspirar o líquido trocando a ponteira em cada lavagem e em cada amostra. - Adicionar 2 ml de substrato em cada canaleta. - Incubar de 10 a 15 minutos na plataforma de agitação. - Aspirar o substrato. - Enxaguar várias vezes com água destilada para parar a reação. - Usando a pinça, retirar as tiras das canaletas e depositá-las sobre papel absorvente para secar. - Montar as tiras sobre folhas do caderno de Western Blot. Se usar fita adesiva para colar sobrea as tiras pois as bandas podem desaparecer.

5 ANTI- 1 Manual CAMBRIDGE BIOTECH -1 POP: BM 05 Página 5 de 7 - Proceder à leitura, observando as bandas presentes e comparando-as com as tiras dos controles (intensidade e posição). - Interpretar o resultado conforme protocolo descrito no item resultados. 10. Controle de qualidade 10.1 Interno Controles Positivos Fraco, Forte e Negativo fornecidos pelo kit. Frequência: os três controles devem ser corridos a cada rotina Externo Vide tabela PCIQ/PAEQ. 10. Resultados 11.1 Unidades Não se aplica 11.2 Cálculos Não se aplica 11.3 Critérios de aceitação Os controles devem apresentar os padrões descritos pelo fabricante na bula do teste. Controle Negativo: Nenhuma banda está visível. Controle positivo Forte: devem estar visíveis todas as bandas relevantes: p17, p24, p31, gp41, p51, p55, p66 e gp 160. A banda gp 120 também pode estar visível, mas não é exigência para a validação da corrida. Controle positivo Fraco: devem estar visíveis as bandas p24 e gp 160. Bandas adicionais podem aparecer, mas não mas não é exigência para a validação da corrida. 12. Valores de referência Soro Não Reagente. 13. Valores críticos Não se aplica. 14. Especificações de desempenho Linearidade: Não se aplica. O desempenho do kit foi avaliado em populações de baixo e alto risco e aidéticos testadas previamente com 5 kits ELISA licenciados.

6 ANTI- 1 Manual CAMBRIDGE BIOTECH -1 POP: BM 05 Página 6 de 7 Grupo ELISA n estudado n negativos n indeterminados n positivos Baixo Negativo (85%) 13 (15%) 0 Risco Positivo (44%) 29 (11%) 126 (45%) Alto Risco Negativo (98%) 2 ( 2%) 0 (0%) Positivo 57 3 (5%) 1 (2%) 53 (98%) AIDS Negativo Positivo (100%) Em estudo adicional para verificar reações cruzadas com as proteínas do foram testadas amostras de pessoas com doenças autoimunes, anticorpos anti-hla, gamopatias policlonais e outras infecções virais não e nenhuma apresentou resultado que pudesse ser interpretado como positivo. 15. Fontes Potenciais de Variabilidade Degradação e/ou contaminação de reagentes e amostras. Resultados de soros analisados em duplicata mostraram que bandas mais intensas que o controle fracamente reagente tem resultados altamente reprodutíveis, porém bandas mais fracas não são tão reprodutivas. 16. Limitações do método Resultados negativos não excluem infecção por -1. Presença de anticorpos anti--1 não constitui diagnóstico para AIDS. Pessoas recentemente infectadas podem apresentar padrões incompletos. Nova amostra coletada após 30 dias deve apresentar aumento do aparecimento de padrões, em número e intensidade de reação. Amostras turvas devem ser previamente centrifugadas xg por 10 minutos. Amostras com contaminação microbiana evidente não devem ser testadas. 17. Interpretação dos resultados A presença ou ausência das bandas é determinada após comparação com as tira dos controles positivos. Existem muitos critérios de interpretação aceitos e recomendados em diferentes regiões. A intensidade das bandas deve ser comparada com a intensidade das bandas nas tiras dos controles positivos fraco e forte: Intensidade do p24 teste < intensidade do p24 C+ fraco: +/- Intensidade do p24 teste > ou = intensidade do p24 C+ fraco e < que C+forte: +

7 ANTI- 1 Manual CAMBRIDGE BIOTECH -1 POP: BM 05 Página 7 de 7 Intensidade do p24 teste > ou = intensidade do p24 C+ forte: ++ Usamos o critério recomendado pelo fabricante que segue recomendações do CDC e ASTPHLD: - Ausência de bandas: Soro não Reagente - Presença de 2 ou mais das seguintes bandas: p24, gp41 e gp120/160 com intensidade maior que 1+: Soro Reagente Presença de qualquer banda viral específica, porém fora do critério Reagente : Resultado Indeterminado. Solicita-se nova coleta. 18. Biossegurança Obedecer às normas de segurança vigentes no laboratório e usar equipamentos de proteção individual 19. Anexos Controle interno no caderno 20. Bibliografia Bula do teste.