PCR (Polymerase chain reaction) Reação em cadeia da DNA polimerase. e suas aplicações

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Washington Benke Canto
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1 PCR (Polymerase chain reaction) Reação em cadeia da DNA polimerase e suas aplicações Bianca Zingales zingales@iq.usp.br

PCR é uma Técnica - Desenvolvida por Kary Mullis e colaboradores em 1983 - É um método rápido e sensível para a amplificação seletiva de sequências de DNA

2 PCR é uma Técnica - Desenvolvida por Kary Mullis e colaboradores em É um método rápido e sensível para a amplificação seletiva de sequências de DNA dupla fita a partir de amostras complexas de ácidos nucléicos. Objetivo: Produzir milhões de cópias de DNA a partir de quantidades mínimas de amostra de partida.

3 Alvo A PCR consegue amplificar uma sequência alvo diluída num mar de DNA

4 Aplicações da PCR Diagnóstico de doenças genéticas e doenças infecciosas (exs: vírus, bactéria, parasita). Medicina Forense (exs: definição da paternidade; identificação de criminoso) Clonagem de um determinado gene

5 A PCR explora as características da replicação do DNA As DNA polimerases só adicionam nucleotídeos a extremidades 3 -OH livres pré-existentes. Usam uma fita simples de DNA como molde (sentido da fita 3 para 5 ) Fita molde

6 Premissas Para aplicar a PCR é necessário ter conhecimento prévio da sequência nucleotídica do gene que se deseja amplificar (sequência alvo ) O sequenciamento do genoma de vários organismos fornece esta informação

7 Oligonucleotídios iniciadores A partir da sequência nucleotídica do alvo, pede-se para uma companhia sintetizar oligonucleotídios iniciadores (primers) para as extremidades da sequência 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' Oligonucleotídios sintéticos (cerca de 20 nt) possuem sequência complementar às pontas 5 e 3 do trecho de DNA que se deseja amplificar

9 REAGENTES PARA PCR 1. DNA parcialmente purificado (organismo; sangue; cabelo; biópsia, etc). 2. O par de oligonucleotídios iniciadores 3. 4 desoxinucleosídios trifosfato (datp; dctp; dttp; dgtp) 4. DNA polimerase

10 1. Desnaturação (95 C) 2. Associação dos iniciadores (55 C) Vários Ciclos 3.Extensão pela DNA polimerase (72 C) Repetição das etapas 1 e 2 25 a 30 ciclos

12 Cada ciclo da PCR tem três etapas em temperaturas diferentes: 1. Desnaturação do DNA 93 C - 95 C 30 secs 1min 2. Associação dos Primers 50 C - 65 C 30 secs 1min 3. Polimerização 72 C 1min (+ 30secs per 500pb DNA) Em geral 20 a 30 ciclos (2 a 3 horas)

polimerase suporta temperaturas elevadas, realizando

13 DNA polimerase termoestável, extraída da bactéria Thermus aquaticus encontrada em fontes hidrotermais A Taq DNA polimerase suporta temperaturas elevadas, realizando reação de síntese do DNA a 72 o C. A enzima não desnatura a 95 o C

14 As amostras são colocadas num aparelho chamado termociclador, que permite mudanças rápidas de temperatura Automatização da PCR

15 A amostra é retirada do termociclador Eletroforese em gel de agarose DNA migra para o polo + Análise 3-4 horas Poço 1 Padrão de Peso Molecular Poços 2, 3 e 4 - Resultado da PCR Poço 5 Controle negativo da PCR (sem DNA) Visualização com luz UV

16 Aplicações 1. Diagnóstico Laboratorial Diagnóstico confirmatório da infecção por HIV Determinação da carga viral Doença de Chagas ativa Critério de Cura Análise de tecido tumoral Determinação do sexo em células pré-natais Muitos OUTROS diagnósticos...

17 HIV DNA do vírus integrado no DNA do linfócito

DIAGNÓSTICO CONFIRMATÓRIO Deteção do DNA do HIV-1 integrado ao genoma leucocitário - 2 ml de sangue coletados dos indivíduos com suspeita H, A, B e C; - Extração do DNA do sangue (leucócitos +

18 DIAGNÓSTICO CONFIRMATÓRIO Deteção do DNA do HIV-1 integrado ao genoma leucocitário - 2 ml de sangue coletados dos indivíduos com suspeita H, A, B e C; - Extração do DNA do sangue (leucócitos + vírus); - PCR: o DNA do vírus foi amplificado com (DOIS!!!) iniciadores específicos; - Uma amostra de HIV controle foi amplificada em paralelo. - Os produtos foram analisados em gel de agarose HIV Padrão do HIV Conclusão: Confirmação da infecção nos pacientes H e A

19 Determinação do sexo em células pré-natais 1. Óvulos fertilizados in vitro 2. De cada embrião tirar uma célula e extrair o DNA 3. Fazer PCR com iniciadores do gene do cromossomo Y ( ) Quais embriões são do sexo masculino?

20 PCR para DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS Mutações no gene BRCA1 e 2 Distrofia muscular Talassemia Fenilcetonúria Fibrose cística Doença de Tay-Sachs etc

21 PCR em Medicina Forense Identificação de criminoso Identificação de restos humanos Teste de Paternidade

22 Material utilizado em Medicina Forense Blood Semen Tissue Urine Hair Teeth Saliva Bone

23 Caso verídico Fonte: 8:exames-de-dna-ajudam-identificacao-do-autor-do-assasinato-da-dentista-desanto-angelo&catid=37&Itemid=69

24 Exames de DNA ajudam a identificação do autor do assassinato da dentista de Santo Ângelo A dentista Márcia Nascimento Gomes, 32 anos, natural de Santo Ângelo, foi encontrada morta e vítima de estupro no dia 27 de abril, na Rota do Sol, no município de Itati, Litoral Norte. Testemunhas fizeram o retrato-falado do criminoso e disseram ser o motorista do caminhão Mercedes-Benz, tipo 1620 ou 1318, com carroceria de madeira e lona preta.

Com base no retrato falado, a polícia identificou 5 caminhoneiros suspeitos que têm

25 A polícia isolou o corpo e identificou manchas de sangue no chão com o reagente luminol. No corpo da vítima foram recuperados pelos pubianos do criminoso. Com base no retrato falado, a polícia identificou 5 caminhoneiros suspeitos que têm antecedentes criminais por abuso sexual. O DNA foi extraído dos pelos encontrados na vitima e do sangue dos suspeitos.

26 Nas amostras de DNA retiradas da cena do crime e obtidos dos suspeitos foi feita a PCR com iniciadores de microsatélites. Os produtos são submetidos a eletroforese. Gel de agarose

27 Terminada a eletroforese olham-se os fragmentos que foram separados DNA coletado na cena do crime DNA dos suspeitos Pergunta-se QUEM É O CRIMINOSO????

28 Procedimento análogo para a Teste de Paternidade determinação da paternidade...

29 No Teste de paternidade: a criança deve ter 50% do padrão de bandas da mãe e 50% do padrão de bandas do pai. Mãe Criança Homem A Homem B Mãe Criança Homem A Homem B Compare as barras da mãe e da criança com as barras dos dois prováveis pais. Quem é o pai?

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