MARCADORES MOLECULARES

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1 MARCADORES MOLECULARES

2 Genética Melhoramento na agricultura até séc. XIX arte e seleção inconsciente 1900s - Descoberta dos princípios genéticos Melhoramento genético científico Utilização de marcadores genéticos moleculares Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples

3 cromossomo marcadores Polimorfismo de DNA resulta acúmulo de mutações pontual ou inserção/deleção macro-rearranjos: translocações, inversões, deleções Obj: identificar polimorfismo diretamente do DNA e associar a genes de grande ou pequenos efeitos no fenótipo

4 Aplicações Genética de populações Análise de fluxo gênico Variação genética Seleção Natural Relações filogenéticas Mapeamento cromossômico Seleção assistida Conservação de recursos genéticos Importância agronômica

5 Histórico de Marcadores Hunter & Markert (1957) - marcas bioquímicas desenvolveram isozimas em gel de amido RFLP por Botstein et al. (1980) PCR por Mullis & Faloona (1987) RAPD por Rafalski et al. (1990) SSR por Akkaya et al. (1992) ISSR por Zietkiewicz et al. (1994)

6 Isozimas As isozimas têm sido usadas em pesquisas de biologia evolutiva principalmente através do estudo detalhado de um loco e as suas variantes alélicas (alozimas) e a utilização de muitos locos para estudos populacionais.

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10 Vantagens e desvantagens herança mendeliana simples. codominância, penetrância completa ausência de pleiotropia e de interações epistáticas disponíveis na população apresentando grande diversidade nível de polimorfismo genético detectável em cada loco é limitado

11 Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP RFLP examina diferença em tamanho de fragmentos de restrição de DNA específicos Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção, deleção Utiliza-se DNA celular total Requer DNA puro de alto peso molecular

12 Sítios de restrição

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17 Vantagens e desvantagens Reprodutível Marcadores co-dominantes Simples Trabalhoso Caro

18 MINI-SATÉLITE OU VNTR Variable number of tandem repeats Sequências repetidas de 15 a 100pb, repetidos 50X Utilizado: identificação de variedades, cultivares clones análise de diversidade genética paternidade

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20 DNA Fingerprint VNTR variable number of tandem repeats

21 DNA Fingerprint

22 Teste de Paternidade

23 Teste de paternidade

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25 DNA Fingerprint

26 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

27 Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD Amplifica sequências anônimas de DNA usando primers arbitrários --10 bases com >50% G+C PCR com um único primer Método rápido para detecção de polimorfismos Marcador dominante Problemas de reprodutibilidade

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34 Vantagens e desvantagens Rápido Simples Baixo custo Sem uso de radio-isótopos Marcador dominante Problemas de reprodutibilidade Problemas de interpretação

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38 Microssatélites (SSR) Sequence-Tagged Microsatelites (STMS) também conhecido como microssatélite ou Simple Sequence Repeat (SSR) Normalmente locus simples e multi-alélico Co-dominante Sequências de 2 a 10pb repetidas

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41 MARCADORES MOLECULARES DE MICROSATÉLITES (SSR)

42 Microsatélites SSR Simple Sequence Repeats Pequenas sequências ( sequence motif ) com 1 a 4 nucleotídeos repetidos em tandem - Amplificados via PCR Classe de marcadores moleculares mais polimórficos Sinonimias SSR (Simple Sequence Repeats); STMS (Sequence Tagged Microsatellites); SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms); Onde são encontrados??? Mamíferos: (CA)n ( a vezes no genoma) Plantas: (AT)n Mitocôndrias

43 Consistem de pequenas sequências ( sequence motif ) com 1 a 4 nucelotídeos de comprimento, repetidas em tandem. Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC Dinucleotídeos Trinucleotídeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC Características: Altamente polimórficos e codominantes (ambos os alelos de um indivíduo heterozigoto são visualizados)

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45 Detecção de locos SSR (PCR) CACACA GTGTGT CACACA GTGTGT (CA) 3 (CA) 3 Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3

46 Aplicações dos Microsatélites Mapeamento genético Diagnóstico de doenças Investigação forense Análise populacional Estudos ecológicos Paternidade Biologia da conservação

47 Como os microsatélites são formados? Modelos para explicar os processos mutacionais envolvidos na formação das repetições Escorregões da DNA polimerase Crossing over desigual

48 Replicação Fita nascente Fita molde Slippage Misalignment +1 repeat -1 repeat

49 Vantagens e desvantagens Altamente reprodutível e informativo detecção por PCR distribuição homogênea no genoma Custo e trabalho envolvidos no desenvolvimento dos primers Construção de bibliotecas genômica sequenciamento Triagem dos melhores primers

50 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorfism)

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