Conceitos Básico sobre Biologia molecular

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1 Conceitos Básico sobre Biologia molecular UFMS Mestre: Paula Cristhina Niz Xavier

2 INTRODUÇÃO A biologia molecular tem aplicação expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis no diagnóstico laboratorial. Diferenças nas espécies (análise forenses). Identificação de gênero, espécies e subespécies Presença de surtos. 2

3 Indústria de Informação A Fábrica A Célula O Manual de Instruções DNA O Dogma Central DNA-RNA-Proteínas Os Operários Proteínas Erros de Programação Doenças Fonte: Marcílio C. P. de Souto - UFRN 3

4 Biologia Molecular Retrata o estudo das células e moléculas Em particular: genoma dos organismos Conjunto de informações genéticas Codificadas em moléculas de DNA 4

5 Cromossomo 5

6 Moléculas nas Células De maneira simplista, cada gene (parte funcional do DNA) codifica uma proteína A forma e o funcionamento de qualquer célula são decorrentes direto ou indiretamente da presença de um arsenal de proteínas. 6

7 Moléculas nas Células As proteínas são macromoléculas informacionais sintetizadas sob o comandos de instruções específicas presente nos ácidos nucléicos (genes). Alterações nos genes podem acarretar em mudanças na conformação e na atuação das nossas proteínas 7

8 Ácidos nucléicos As informações são armazenadas nos ácidos nucléicos DNA ácido desoxirribonucléico RNA - ácido ribonucléico Ambos são polímeros lineares de nucleotídios conectados entre si via ligações covalentes denominadas ligações fosfodiéster 8

9 Nucleotídios Os nucleotídios, unidades básicas dos ácidos nucléicos, são constituídos de Uma base nitrogenada Uma pentose Um grupo fosfato 9

10 Bases Nitrogenadas As bases nitrogenadas são de dois tipos: Púricas: Adenina (A) e Guanina (G) Pirimídicas: Citosina (C), Timina (T) e Uracil (U) 10

11 Pentose Presença ou ausência do grupo hidroxila no C 2' da pentose. 11

12 Ligação entre a Base e a Pentose Esta ligação é feita covalentemente através de uma ligação N- glicosídica com a hidroxila ligada ao carbono-1 da pentose. 12

13 Ligação entre o Fosfato e a Pentose Esta ligação é feita através de uma ligação fosfodiéster com a hidroxila ligada ao carbono-5 da pentose 13

14 Ligação entre os Nucleotídeos Para a formação da molécula de DNA é necessário que ocorra a ligação entre os nucleotídeos Nucleotídeos ligados covalentemente por ligações fosfodiéster -- pontes de fosfato 14

15 Ligação entre os Nucleotídeos Isto determina que o crescimento do DNA se faça na direção de 5' para 3' Ligados covalentem ente por ligações fosfodiéster 15

16 Ligação entre os Nucleotídeos 16

17 Estrutura do DNA A molécula de DNA é uma dupla hélice cujas cadeias estão unidas por pontes de hidrogênio estabelecidas entre purinas e pirimidinas complementares (T = A) (C G) (especificidade) 17

18 Tipos RNAs As células possuem muitos tipos diferentes de moléculas de RNA que executam trabalhos diversos Os tipos de RNA que participam do processo de síntese protéica são: RNA mensageiro (mrna), RNA transportador (trna) RNA ribossômico (rrna) 18

19 O Dogma Central e os Moldes Década de 50, hipótese do DNA molde de RNA Baseado neste raciocínio, Francis Crick propôs em 1956 o dogma central da biologia, salientando o fluxo unidirecional da informação: do DNA à proteína 19

20 O Dogma Central e os Moldes 1965, com o isolamento da enzima replicase codificada por um vírus infeccioso de RNA de simples. Foi demostrado que o RNA também podia servir de molde à síntese de outras moléculas de RNA 20

21 O Dogma Central e os Moldes 1970, com a enzima transcriptase reversa Sintese de DNA utilizando-se RNA como molde 21

22 O Dogma Central e os Moldes Estes novos conhecimentos permitiram que o dogma central se ampliasse sem, contudo, perder a unidirecionalidade, ou seja, de ácido nucléico para proteína 22

23 Enzimas envolvidas 23

24 Replicação do DNA Replicação do DNA é o processo de auto-duplicação do material genético mantendo assim o padrão de herança ao longo das gerações 24

25 Expressão Gênica Transcrição RNA Polimerase DNA T G C A G C T C C G G A C T C C A T... promotor Transcrição mrna A C G U C G A G G C C U G A G G U A... A informação genética contida num segmento do DNA, é reescrita em uma fita simples de RNA A seqüência é sempre escrita no sentido 5'-> 3' 25

26 Expressão Gênica Tradução DNA RNA Polimerase T G C A G C T C C G G A C T C C A T... promotor Ribossomo Transcrição mrna 5 A C G U C G A G G C C U G A G G U A... 3 códon Tradução trna His 26

27 Tradução DNA RNA Polimerase T G C A G C T C C G G A C T C C A T... promotor Transcrição mrna A C G U C G A G G C C U G A G G U A... Ser Tradução His Ribossomo Cis Ser Gli Leu 27

28 Extração de ácidos nucleicos 28

29 Isolamento de DNA genômico 29

30 Isolamento de DNA genômico 30

31 Isolamento de DNA genômico Quantificação de DNA extraído (10 ng) Relação 260/280 = 1.8 < pouco DNA > Contaminado com proteína 260 = quantidade das bases (nucleotídeos) / 280 = quantidade de tirosina de proteínas 31

32 Isolamento de RNA genômico Semelhantes ao DNA Exceto: - Mais etanol para precipitar (2,5 volumes); - Toda água usada na reação (tampões), seja tratada com DEPEC (dietilpirocarbonato) -- inativa Rnases; 32

33 MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR PCR 33

34 Métodos de Biologia Molecular: Opção no diagnóstico laboratorial Nova opção de identificação, supera as limitações dos métodos de identificação tradicionais, (demorados) inaceitáveis para a iniciação da terapêutica (WHITE et al., 2003). 34

35 Técnicas de uso corrente na avaliação da diversidade genética PCR convencional PCR nested RAPD-Randon Amplified Polymorphic DNA RFLP-Restriction Fragment Length Polymorphism Southern Blotting - DNA Northern Blotting - RNA Wersthern Blotting - proteínas PCR em tempo real Sequenciamento de DNA 35

36 Métodos de biologia molecular Diferentes métodos com aplicação de biologia molecular têm sido desenvolvidos. A reação em cadeia da polimerase (PCR): constitui técnica rápida, segura sensível na identificação de diferentes patógenos 36

37 Métodos de biologia molecular Esse ensaio utiliza uma seqüência pequena (15 a 40 pares de bases) de primers aleatórios para amplificar seqüências alvo de DNA. 37

38 Princípios do PCR PCR (Polimerase Chain Reaction) Permite amplificar o DNA ou RNA utilizando uma reação enzimática catalizada pela polimerase cuja atividade depende do íon Mg +++, e ocorre em 3 etapas Desnaturação, anelamento e extensão 38

39 PROPRIEDADE DOS ÁCIDOS NUCLEICOS 39

40 Propriedades dos ácidos nucléicos Bastante estáveis Podem ser dissociados e associados por processos químicos e físicos temperaturas (90 a 100º C) ou ph extremos (< 3 ou > 10) Separação da fita (desnaturação). 40

41 Propriedades dos ácidos nucléicos Temperatura 65º C e ph próximo de 7 reconstituição (anelamento) 41

42 Propriedades dos ácidos nucléicos Capacidade de absorver energia ultravioleta. Atingir picos de absorbância máximo a 260nm. 42

43 Fatores que influenciam o PCR Atividade enzimática da Taq polimerase O proporciona o aparecimento de produtos indesejáveis (dimeros). Utilizada em unidades. 43

44 Fatores que influenciam o PCR Presença de dntp sol. de estoque 10mM -20ºC sol. de uso 1mM de cada ser incorporado a solução. 44

45 Fatores que influenciam o PCR [ ] de Mg ++ Pode afetar a desnaturação, o anelamento, o produto final, a especificidade e a ação da Taq polimerase. Levando a dimerização do primer prejudicando a fidelidade do esperimento. Cuidado com EDTA da amostra (interferência) 45

46 Fatores que influenciam o PCR 46

47 Preparando a PCR (área Fisica) Campo limpo DNA-free Campo Contaminado 47

48 Preparando a PCR (área Fisica) 48

49 Cuidados durante a PCR 49

53 Preparando a PCR Campo limpo Mix - H2O =? Tampão = 5 µl dntp = 3 µl 10,3 µl MgCl2 = 1,5 µl primer = 1 µl TAQ = 0,2 µl amostra = 1 µl Volume final = 25 µl 53

54 Preparando a PCR Campo Contaminado amostra = 1 µl Volume final = 25 µl 54

55 Números de ciclos De 35 a 40 ciclos > 40 ciclos (algo está errado); < quantidade de ciclos pode acarretar um baixo rendimento do produto 55

56 Separação das moléculas de DNA Eletroforese Técnica de separação que envolve o movimento de partículas com cargas em solução, sob ação de um campo eletrico. Cuba de eletroforese 56

57 Separação das moléculas de DNA Eletroforese 57

58 Separação das moléculas de DNA 58

59 Fatores que influenciam a separação do DNA Tamanho da molécula de DNA;(Ladder) Concentração do gel (agarose ou policrilamida); Corrente aplicada -- a carga, a mobilidade dos fragmentos de DNA. 59

60 Fatores que influenciam a separação do DNA 60

61 61

62 Fatores que influenciam a separação do DNA Tampão utilizado TAE (tri-acetato); TPE (trifosfato); TBE (triborato); 62

63 Coloração do DNA Brometo de etídio -- Sybr safe -- Gel red Detecta tanto ácidos nucleicos de fita dupla e simples (< afinidade). 63

64 Brometo de etídio -- coloração de DNA 64

65 Sybr safe -- coloração de DNA DNA de CMV 65

66 Números de ciclos Um ciclo = 3 min. Uma hora = um milhão cópias < de 2h = um bilhão Produto amplificado pode alcançar 10 6 cópias em 30 ciclos 66

67 Princípios do PCR em Tempo Real Associa PCR a um sistema de detecção e quantificação de fluorescência produzida durante os ciclos de amplificação. * Identifica * Detecta * Quantifica Única etapa -- riscos de contaminação. 67

68 Princípios do PCR em Tempo Real Fluorocromos - SybrGreen Sondas - Taqman 68

69 Princípios do PCR em Tempo Real 69

70 PCR em Tempo Real 70

71 71

72 Enzimas de restrição Década de 60 Bactérias produzem enzimas que clivam o DNA proteção Endonucleases enzimas de restrição Pesquisa reconhecer sequencias específicas conhecidas como ~sequencias de reconhecimento ou sítio de restrição. 72

73 Enzimas de restrição 73

78 Vamos as avaliações 78