REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

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1 Área de Ciências da Saúde Curso de Medicina Módulo: Saúde do Adulto e Idoso II GENÉTICA HUMANA Professora: Dra. Juliana Schmidt REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) A molécula de DNA é um longo polímero composto de quatro componentes diferentes chamados bases. As quatro bases que compõe os nucleotídeos podem apresentar várias combinações para criar um código de DNA ou seqüência única (também genótipo, gene e alelo). Nucleotídeos são compostos por três componentes diferentes: A base nitrogenada açúcar Desoxirribose grupo Fosfato Cada nucleotídeo contém o açúcar ribose e o mesmo o grupo fosfato. O que torna cada um único nucleotídeo é a sua base de nitrogênio. Existem quatro bases nitrogenadas: Adenina (A), Timina (T), Guanina (G) e Citosina (C). Uma cadeia de nucleotídeos do DNA é criado pela ligação do grupo fosfato com o açúcar do nucleotídeo seguinte. Esta ligação cria a "espinha dorsal" da molécula de DNA. Para designar as diferentes finalidades desta cadeia de fita simples, usamos alguns típicos terminologia bioquímica, no qual os carbonos em qualquer açúcar são contados. O açúcar de um nucleotídeo contém 5 carbonos. O grupo fosfato (PO4) de um nucleotídeo é ligado ao carbono 5 'do açúcar. Um grupo hidroxila (OH) é ligado ao carbono 3 ' do açúcar, e este 3 'grupo OH liga-se ao grupo fosfato do nucleotídeo seguinte na da cadeia. Assim, ao final de uma única molécula de DNA que tem um grupo fosfato livre (isto é, não anexado a outro nucleotídeo) é chamado de terminal 5 ', e no final da molécula de DNA (sem subseqüentes de nucleotídeos em anexo) é chamado extremidade 3 '. Existem várias propriedades importantes da dupla fita de DNA: A estrutura pode ser vista como uma escada torcida. Os esqueletos de desoxirribose-fosfato são os lados da escada. As bases de nitrogênio (A, T, G e C) ligados uns aos outros são os degraus. Apenas as bases nitrogenadas A e T e C e G podem formar pontes de hidrogênio entre si. Quando A se liga a um T ou C se liga a G este é considerado o pareamento de base. Nem C e T, nem A e G formam pontes de hidrogênio. As duas fitas são antiparalelas, ou seja, as fitas são orientados em direções opostas. Isto significa que a escada corre 5 'para 3' em uma direção em uma fita e 5 'para 3' na direção oposta na outra fita. As duas fitas são complementares, correndo em direções opostas. Estas duas fitas complementares anelam ou hibridizam uma com a outra através de pontes de hidrogênio entre suas bases nitrogenadas. Uma nova fita de DNA pode ser sintetizada utilizando a sua cadeia complementar como a modelo para a síntese de novo. O comprimento de qualquer molécula de DNA dupla-fita é dada em termos de pares de base (pb). Se uma fita de DNA contém mais de mil pares de bases, a unidade de medida é kilobases (1 kb = 1000 bp). Se houver mais de um milhão de pares de bases em uma fita, a unidade de medida é megabases (1 Mb = 1000 kb). Na replicação do DNA novas fitas são sintetizadas por enzimas denominadas DNA polimerases. Novas fitas são sempre sintetizada no sentido 5 'para 3'. Para uma nova fita de DNA a ser sintetizado, outro fita única é necessária. A fita única de DNA que será usado para sintetizar sua fita complementar é chamada de fita molde. No entanto, para que a DNA polimerase possa iniciar a síntese de uma nova fita complementar, um pequeno trecho de nucleotídeos (aproximadamente 20 pares de base) chamado de oligonucleotídeo iniciador devem estar presente

2 para a polimerase iniciar a síntese. Este iniciador é uma porção curta de nucleotídeos complementares ao modelo no local em que o pesquisador quer começar a síntese. O primer deve ter um grupo 3 'livre hidroxila (OH) para a DNA polimerase para anexar o 5 'grupo fosfato do nucleotídeo seguinte. A DNA polimerase catalisa a ligação de nucleotídeos, juntando o fosfato do nucleotídeo novo com a hidroxila 3 'da nova cadeia complementar. A fita recém-sintetizada mantém a sua complementaridade com a fita molde porque a DNA polimerase só adiciona novos nucleotídeos durante a síntese da nova fita se o nucleotídeo novo tem seu complemento na fita molde. Por exemplo, a DNA polimerase só irá adicionar um G na fita recém-sintetizada se houver em contrapartida um C na fita molde para formar uma ligação de hidrogênio. Guanina não será unida à nova fita se adenina, timina, guanina é o nucleotídeo oposto na fita molde. Nos últimos 20 anos, muitos ganhos na área de técnicas de ácido nucléico permitiram aos pesquisadores estudar os papéis de ácidos nucléicos em processos da vida. Em 1983, Kary Mullis desenvolveu a técnica de biologia molecular que desde então revolucionou a pesquisa genética. Esta técnica, chamada de reação em cadeia da polimerase (PCR), transformou a biologia molecular em um campo de pesquisa multidisciplinar. O objetivo da PCR é produzir uma grande quantidade de DNA em um tubo de ensaio (in vitro), a partir de apenas uma pequena quantidade de DNA, usando um processo de amplificação enzimática controlada de uma seqüência de DNA ou gene de interesse. As fitas modelo podem ser qualquer forma de DNA, como o DNA genômico. Um pesquisador pode usar pequenas quantidades de DNA genômico a partir de uma gota de sangue, um único folículo piloso, ou uma célula bochecha, e fazer DNA suficiente para estudar. Em teoria, apenas uma molécula de DNA modelo é necessária para copiar e gerar milhões de novas idênticas moléculas de DNA. Antes da PCR isto seria impossível. É a capacidade de amplificar a sequência precisa do DNA de interesse que é o verdadeiro poder do PCR. A PCR teve um impacto em quatro áreas principais de pesquisa genética: mapeamento genético; clonagem; seqüenciamento de DNA, e detecção de genes. A PCR é usada agora como uma ferramenta para diagnóstico médico para detectar mutações específicas que podem causar doenças genéticas; em investigações criminais e tribunais de justiça para identificar suspeitos; no seqüenciamento do genoma humano; indústria farmacêutica,; agrícola entre outros. A reação em cadeia da polimerase possibilita a amplificação de uma seqüência específica de DNA a partir de uma mistura complexa, sem a necessidade de clonagem molecular. Esta técnica é amplamente utilizada em pesquisa básica, em medicina forense e no diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas. Todo o processo ocorre de modo semelhante a replicação do DNA in vivo. Inicialmente, é necessária a construção por síntese química de dois oligonucleotídeos de DNA (iniciadores) complementares as extremidades de cada fita de DNA, flanqueando a região de interesse. Estes oligonucleotídeos servem como iniciadores da síntese de DNA in vitro, que é catalisada pela DNA polimerase. Um ciclo de PCR começa com a desnaturação por calor (95 C), que promove a separação da fita dupla de DNA. A reação é resfriada na presença de um excesso dos dois oligonucleotídeos, possibilitando a hibridização dos dois iniciadores com a seqüência complementar presente no DNA alvo. Em seguida, a reação é incubada para atuação da DNA polimerase, que produzirá novas fitas de DNAs a partir dos iniciadores e utilizando os quatro desoxirribonucleotídios (datp, dctp, dgtp e dttp), como vizualizado na figura a seguir:

3 A cada novo ciclo da reação inicia-se com o aquecimento para desnaturação da dupla fita de DNA, seguido de resfriamento para hibridação dos iniciadores e síntese de uma nova fita pela DNA polimerase a partir dos iniciadores, sendo que as fitas de DNA recém sintetizadas servem de molde no ciclo seguinte. Portanto, em cada ciclo é sintetizado o dobro do DNA produzido no ciclo anterior. Usualmente, são realizados de 20 a 40 ciclos para amplificação de um segmento de DNA específico dentro de um genoma.

4 Nas primeiras iniciativas para amplificar fragmentos de DNA utilizava-se a enzima DNA polimerase da Escherichia coli, que possui atividade máxima a 37 C. Esta enzima deveria ser adicionada a cada ciclo pois o passo de desnaturação inativa a enzima. Um importante avanço ocorreu com a descoberta da enzima Taq DNA polimerase oriunda da bactéria Thermus aquaticus. A Taq DNA polimerase possui atividade ótima a 72 C e permanece razoavelmente estável mesmo a 95 C e com isto, a enzima é adicionada somente no inicio do processo. Para realizar uma PCR são necessários: Polimerase termoestável: Taq DNA polimerase (Thermus aquaticus) DNA Molde Primers (oligonucleotídeos com sequência complementar ao molde) dntps(a,t,c,g) Tampão com Mg Termociclador Nesta atividade, você vai amplificar uma região dentro de seu cromossomo 16, correspondente a um elemento Alu na região PV92 do cromossomo 16. Este elemento Alu particular é dimórfico, o que significa que o elemento está presente em alguns indivíduos e outros não. Algumas pessoas têm a inserção em uma cópia do cromossomo 16 (um alelo), outros podem ter a inserção em ambas as cópias do cromossomo 16 (dois alelos), enquanto alguns podem não ter a inserção em cada cópia do cromossomo. A presença ou ausência destas inserções podem ser detectadas usando PCR seguida de eletroforese em gel de agarose. Os iniciadores apresentam sequências específicas para hibridizar com a sequência de nucleotídeos presente adjacente ao elemento Alu.

5 Área de Ciências da Saúde Curso de Medicina Módulo: Saúde do Adulto e Idoso II GENÉTICA HUMANA Professora: Dra. Juliana Schmidt AMPLIFICAÇÃO DE DNA POR PCR OBJETIVO Promover a amplificação de um determinado segmento de DNA presente no cromossomo 16 humano. MATERIAIS - solução contendo DNA genômico - termociclador - Master Mix PCR PV92 (Biorad) - ponteiras de 10 e 200µL - Primer Mix PCR PV92 (Biorad) - micropipetas de 20 e 200µL - Controles Homozitos (+/+) e (-/-) e heterozigoto (+/-) PCR PV92 (Biorad) - microtubos de 200µL - Isopor com gelo picado - PROCEDIMENTO 1. Preparar um microtubo contendo: Reagentes Quantidade (µl) Conc. Final Master Mix 20 - Solução contendo DNA genômico 20 - Primer mix 0,4 2. Adicionar os primers por último imediatamente antes de colocar no termociclador 3. Programar o termociclador da seguinte maneira 94 C 2 94 C 1 60 C 1 72 C 2 72 C 10 40X 4. Ao final do processo, retirar o microtubo do termociclador e guardá-lo a -20 C para posterior análise eletroforética.

6 Área de Ciências da Saúde Curso de Medicina Módulo: Saúde do Adulto e Idoso II GENÉTICA HUMANA Professora: Dra. Juliana Schmidt AMPLIFICAÇÃO DE DNA POR PCR Relatório de aula prática Data: / / - Turma: Nota: RESPONDA AS QUESTÕES A) Para realizar a PCR são necessários os seguintes componentes. Qual é a função de cada um deles na reação? Taq DNA polimerase: DNA Molde: Primers ou iniciadores: dntps(a,t,c,g): Tampão com Mg: B) Explique o que ocorre dentro do tubo de PCR em cada um dos ciclos do termociclador. 94 C 1 60 C 1 72 C 2 40X