Biologia Molecular. Técnicas Moleculares. Lucas Brandão

Transcrição

1 Biologia Molecular Técnicas Moleculares Lucas Brandão

2 CONCEITOS BÁSICOS

3 Núcleo - Célula Humana

4 DENTRO DO DNA SE ENCONTRAM OS GENE

5 Definição de Genes Estrutura Gênica n=23, X ou Y 5 UTR 1 Pai Introns 2 Aa 3 Aa Mãe 3 UTR Promotor Locus Gênico Exons Homozigoto Heterozigoto Selvagem Mutante

6 A a Alelo A Alelo a A T T G C A G T G C Porque é diferente?

7 MUTAÇÃO! É O PROCESSO PELO QUAL OS GENES MUDAM DE UMA FORMA ALÉLICA PARA OUTRA. É UMA MUDANÇA PERMANENTE NUMA SEQUÊNCIA DE BASES NO DNA. É a origem da diversidade genética dos indivíduos

8 DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

9 Histórico do DNA

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13 Estrutura do DNA

14 A Dupla Hélice James Watson & Francis Crick (1953)

15 Estrutura das Bases nitrogenadas

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21 Estrutura das Bases nitrogenadas Purínicas Pirimidina

22 Estrutura dos Nucleotídeos Estrutura dos nucleotídeos mono-, di- e trifosfatados. Os desoxirribonucleotídeos correspondentes são abreviados dnmp, dndp e dntp. N = A, G, C, U ou T.

23 Tipos de Nucleotídeos ou da ou A ou dt ou T ou dg ou G, ou dc ou C Estrutura dos desoxirribonucleotídeos 5 -monofosfatados (dnmp)

24 Polinucleotídeos 5 -terminal Ligações fofosdiester 3 -terminal

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26 Estrutura Secundária Antiparalelismo As fitas do DNA estão dispostas em direções opostas

27 Complementariedade Cada base de uma fita é pareada com a base complementar da outra fita

28 A Dupla Hélice As duas fitas do DNA se torcem para formar uma dupla hélice (estrutura secundária do DNA)

29 A Dupla Hélice Fatores que estabilizam a dupla hélice: interações hidrofóbicas forças de van der Walls pontes de hidrogênio Entre as bases nitrogenadas interações iônicas Entre os grupos fosfato do DNA e os cátions (Mg 2+ ) presentes na solução fisiológica

30 A Dupla Hélice A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos quais se ligam as proteínas da cromatina Sulco menor Sulco maior

31 A Dupla Hélice

32 Origem do Material Genômico Extração de DNA Texto de Marcador de Posição Definido pelo Usuário

33 DNA Célula Humana Nucleada Núcleo

34 Existem inúmeros materiais biológicos humanos que apresentam células nucleadas - Tecido - Excreção Saliva, sangue, urina, escarro Lavagem broncoalveolar Fluido cerebroespinhal, Fluido pleural Secreção vaginal, esperma Célula Humana Nucleada Cortes de tecidos (biópsias frescas ou em blocos de parafina). Bulbo capilar, células aderida na unha

35 EXTRAÇÃO DE DNA DE SANGUE PERIFÉRICO TOTAL

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48 Reação em Cadeia da Polimerase Histórico Metodologia Componentes Adaptações Utilizações Riscos 1 Professor: Lucas Brandão

49 Histórico! Mullis inovou: Conseguiu especificidade na cópia de apenas segmentos específicos, introduzindo o conceito de primer de PCR, e na utilização de uma DNA polimerase termoestável. Mullis Taq DNA polimerase P e r m i t e a mudança na temperatura Thermus aquaticus Primer Especificidade da reação Fig. 1: Kary Mullis, inventor da PCR, em foto de 1994 (Nobel Academy) 4 Mimetizar a replicação do DNA em regiões específicas do genoma

50 Estrutura do DNA Bases purínicas A e G Bases pirimidínicas T e C Polaridade Fosfato Fendas Açucar desoxirribose Bases Nitrogenadas Conformações 5

51 Replicação do DNA Um conjunto de enzimas irá atuar no DNA para permitir sua replicação. Resumidamente, o DNA deve ser aberto, para que sejam inseridos iniciadores, e a enzima DNA p o l i m e r a s e c o n s t r u a u m a f i t a complementar no sentido 5 para 3. 6

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53 PROCESSO DE REPLICAÇÃO O movimento da forquilha de replicação revela uma fita molde no sentido 3 5 e outra no sentido oposto 5 3 Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidos opostos FITA LEADING crescimento segue a direção do movimento da forquilha de replicação FITA LAGGING crescimento no sentido oposto ao movimento da forquilha de replicação

54 Aquecer PCR Etapas Desnaturação DNA Inserir os Primers Anelamento Sintetizar um fita de DNA Extensão 7

55 Primers São pequenas seqüências oligonucleotídeos DNA molde Primer Especificidade da Reação 8

56 Genoma 5 mil genes 3 Gene A C G C A T T G C T G A A A G A A G C G 3 OH T A A C G A C T T T C G C 3 OH 5 G C G 3 9

57 Taq polimerase Atividade ph Cofatores Temperatura Ideais A enzima "lê" a fita molde e faz a fita complementar incorporando deoxirribonucleotídeos tri-fosfatados 10

58 dntps Fosfato Açucar 11

59 Componentes 3 dctp G C G MgCl 2 datp Tampão Taq Gene A 3 OH dttp G dgtp C G 3 OH 5 12 Polymerase Chain Reaction

60 Reagentes Necessários para a Reação 1. DNA molde; 2. Solução Tampão da Taq polimerase: *Íons (Na, Cl e K, entre outros); *Detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40), inibindo a formação de dímeros das cadeias enzimáticas; *Proteínas estabilizantes (BSA) e *Algumas substâncias que agem na desnaturação da cadeia molde de DNA (DDT e! -mercaptoethanol), quebrando as pontes de hidrogênio entre as bases. 13

61 3. MgCl 2, doador muito estável de íons Mg 2+, que são cofatores indispensáveis para atividade da enzima.. 4. Primers Forward e Reverse 5. Os desoxinucleotídeos são a matéria-prima propriamente dita para a síntese das fitas-filhas. São compostos por nucleotídeos (ATP, TTP, CTP, GTP). 6. Temperatura 14

62 Etapas Ciclos Desnaturação Extensão Anelamento Tempo 15

63 16 Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o primeiro termociclador automático

64 17 Polymerase Chain Reaction

65 A quantidade de DNA final segue uma função exponencial, onde: N = N 0. 2 n N = Número final de cadeias de DNA N 0 = Número inicial de DNA molde (template) n = Número de repetições do ciclo Portanto, a concentração final do DNA molde na solução é muito maior (da ordem de 235 ) do que a inicial, possibilitando a sua identificação. 18

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67 Utilidades É amplamente usada numa variedade de aplicações na biologia molecular: Mapeamento gênico, clonagem sequencimento de DNA expressão gênica Paternidade diagnóstico de doenças genéticas detecção e identificação de vírus, como HIV e HCV 20

68 PORQUE OTIMIZAR A PCR? Otimiza-se a reação da PCR para: Aumentar o rendimento da reação (eficiência) Aumentar a especificidade Aumentar a reprodutibilidade (poço-poço, corrida-corrida) 21

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77 TIPOS DE REAÇÕES MAIS RECENTES:! 1. RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction):! Esta reação é composta de 2 partes: a transcrição reversa e a amplificação. Seu principal diferencial é que na verdade esta reação não parte de um molde de DNA diretamente extraído da amostra; a amostra fornece o RNA, que é convertido em cdna (DNA complementar). Ferramenta útil em estudos de expressão gênica, pois avaliando o mrna, podemos detectar quais proteínas estão sendo efetivamente expressas. 30

78 ! Além disso, também são utilizados primers, mais inespecíficos e nunca em pares. São oligonucleotídeos compostos por várias timinas consecutivas (6 a 35), que são anelados às regiões Poly-A (ou A-Rich) do RNA, ricas em adeninas. Após este ciclo, obtém-se o cdna que será utilizado na PCR. É importante ressaltar que o round de transcrição reversa não altera o número de fitas de RNA ou DNA. 31

79 2. Multiplex PCR:!! Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação, cada um com seu par de primers específico. Esta vantagem pode simplificar alguns experimentos, como a investigação de paternidade, onde vários marcadores genômicos devem ser analisados. 32

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81 3. Nested PCR:! Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificação da real seqüência-alvo. Estas duas etapas (rounds) podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente, caracterizando o Semi-Nested PCR. 34

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83 36 Fig. 5: Esquema de uma reação de Nested PCR. O produto da amplificação do 1º Round é utilizado com template no 2º round. No final das duas etapas, obtém-se um produto menor que o da primeira amplificação. Este tipo de reação tem como vantagem o ganho em especificidade e eficiência, uma vez que o DNA-molde do 2º round está em concentrações altíssimas, e os primers da segunda etapa têm menos chances de anelamento em seqüências inespecíficas, dada a redução do tamanho do molde.

84 RAPD DNA POLIMÓRFICO AMPLIFICADO AO ACASO 37

85 PCR Dois Primers Construção PRIMER Conhecimento da Seqüência do DNA Produção de um fragmento específico 38

86 Genoma 5 mil genes 1 pedaço genes 3 Gene A 5 39

87 Estringência x Especificidade Temperatura Especificidade 45 o C 3 Gene A 5 40

88 RAPD Randômico 3 OH A C G Apenas um primer Pequeno = 10-15pb 3 5 C G T A T T G C T G A A A G A A G C AG 3 OH T A A C G A C T T T T G C 3 OH 5 A C G 3 41

89 Foi descrita simultaneamente por Williams et al. (1990) e Welsh & McCleland. (1990). amplificação de seqüências de DNA randômicas utilizando iniciadores pequenos de seqüências arbitrárias 42

90 Utilidades : Mapas genéticos, Diferenciação de espécies animais e vegetais e para Impressões de DNA, com especial utilidade nos estudos de genética de populações. 43

91 44 1º Indivíduo 2º Indivíduo

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93 Surto Infecção Hospitalar Kluyvera sp Kb ,5,6,7, Kluyvera sp

94 5. AFLP (polimorfismo de tamanho de fragmento amplificado)!!. 53

95 54 RFLP

96 Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

97 ANÁLISE DOS PRODUTOS DA PCR Eletroforese Horizontal Idéia Equipamentos Lucas Brandão 1

98 Produto da PCR 3 Gene A 5 2

99 Baseada Molécula de DNA Carga Tamanho e peso Negativa Agrupamentos fosfatos 3

100 Idéia Diferença de potencial Malha Eletroforese Geis - DNA + 4

101 Gel Agarose Poliacrilamida 5

102 Derivado do agár-agár Agarose Insolúvel em agua fria Rhodophytas Malha 6! ou " concentração Subunidades de galactose

103 Concentração do Gel 0,6 % 1% 2,5% Tamanho do Amplicon Grandes Finalidade Médios Pequenos 7

104 8 Logística

105 Preparação do Gel: Após o preparo os géis serão colados na cuba de eletroforese contendo o tampão de corrida TAE (Tris Acetato EDTA) ou TBE (Tris Borato EDTA) os quais também são os diluentes da agarose. Em seguida, as amostras são adicionadas ao gel e correrão entre V durante 60 min. 9

106 Poços 10 a 150#L Aplicar o produto da PCR 10

107 Preparo da Amostra Amostra + Água + Tampão de amostra 11

108 12 Eletroforese

109 Eletroforese 50 a 100mV DNA Corante 13

110 Coloração com Brometo Duas estratégias Pré-corrida Pós-corrida BROMETO DE ETÍDIO C21H2OBrN3 A T T G C A T T A A C G T A 14

111 Visualização Aparelho que emite raios UV. As bandas podem ser identificadas como pequenas faixas fluorescentes 15

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113 16 Ladder

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115 Gel de poliacrilamida montado em cuba de eletroforese e sendo submetido à uma voltagem de 69V. 18

116 COLORAÇÃO COM PRATA A identificação dos produtos pode ser feita pela coloração com EtBr, porém o método mais utilizado é a impregnação do DNA contido no gel por nitrato de prata. Logo após a corrida, o gel é fixado com uma solução de etanol e ácido acético, para impedir a eluição (formar borrões no gel) das amostras. 19 A coloração por prata é de bem mais fácil visualização do que a oferecida pelo EtBr, além de ser mais segura, levando-se em conta o fato de que este é altamente carcinogênico.

117 20 Gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata. Devido à alta sensibilidade do método de coloração, observa-se bandas inespecíficas e DNA não amplificado no pé da foto. A seta indica a corrida do Ladder.

118 Interpretação Caso : Diagnóstico viral

119 22 Interpretação