DNA polimerases dependentes de "template"

Transcrição

1 DNA polimerases dependentes de "template" - Adicionam deoxiribonucleótidos à extremidade 3' de cadeias duplas de DNA com um local de "priming" - A síntese ocorre exclusivamente na direcção 5'-3' da nova cadeia - Muitas DNA polimerases possuem actividade exonucleásica 3'-5' associada à actividade polimerásica - Esta actividade leva à remoção de um nucleótido de cada vez com libertação de nucleósideo 5'-monofosfato - Na ausência de dntp's, esta actividade promove a degradação, nucleótido a nucleótido, das extremidades 3' de DNA de cadeia dupla e simples 1

2 - Algumas polimerases têm actividade exonucleásica 5'-3' - Esta actividade degrada DNA de dupla cadeia a partir da extremidade 5' - A actividade exonucleásica 5'-3' remove um ou vários (até 10) nucleótidos de cada vez e permite a estas polimerases iniciar a síntese de DNA em "nicks" de DNA de cadeia dupla - Nick translation 2

3 Processividade de DNA polimerases - Capacidade da DNA polimerase de incorporar nucleótidos de forma contínua num determinado template sem se dissociar, isto é, sem "cair" do template - A maior parte das DNA polimerases têm baixa processividade e são incapazes de incorporar mais de 10 nucleótidos de cada vez E. coli DNA polimerase I - Produto do gene pola - Tem actividades exonucleásicas 3'-5' e 5'-3' - A actividade 5'-3' está localizada na extremidade N-terminal da proteína e as actividades polimerásica e exonucleásica 3'-5' na extremidade C-terminal. A remoção da extremidade N-terminal (digestão proteica ou deleção) origina uma DNA polimerase com actividade exonucleásica 3'-5' - Fragmento Klenow Aplicações da DNA polimerase I nativa - Nick translation (nicks são criados pela adição de quantidades vestigiais de DNAse I) 3

4 4

5 Aplicações do fragmento Klenow - Marcação das extremidades 3' de moléculas de DNA (após digestão com enzima que produza extremidades 5' livres) - Reparação de extremidades 3' e 5' livres para gerar blunt ends - Marcação uniforme de DNA por "random-sequence oligonucleotideprimed synthesis" - Baseia-se na utilização de primers de sequência aleatória que promovem a incorporação de nucleótidos marcados em vários locais da sequência template desnaturada. - Sequenciação de DNA - Síntese da segunda cadeia de cdna's T4 DNA polimerase - Produto do gene 43 do bacteriófago T4 - Alta actividade exonucleásica 3'-5' Aplicações - Marcação de extremidades 3' - "Replacement synthesis" - A incubação do DNA com T4 DNA polimerase na ausência de nucleótidos leva à degradação da cadeia dupla de DNA a partir da extremidade 3'. Depois de um determinado período de tempo são adicionados dntp's marcados que vão substituir as cadeias degradadas - Conversão de extremidades 3' e 5' livres em blunt ends 5

6 T7 DNA polimerase - Complexo de duas proteínas - Produto do gene 5 do bacteriófago T7 e do gene da Tioredoxina de E. coli - Elevada processividade Aplicações - Usada para a síntese de cadeias de DNA longas - permite a polimerização de milhares de nucleótidos - Enzima de eleição para a síntese da cadeia complementar em "sitedirected mutagenesis" Taq DNA polimerase - Isolada da bactéria termófila Thermus aquaticus - Temperatura óptima de actividade de 75 0 C - Não tem actividade exonucleásica 3'-5' Aplicações - PCR - Sequenciação de DNA 6

7 DNA polimerases independentes de template Terminal transferase - Cataliza a incorporação de nucleótidos na extremidade 3' de DNA sem necessidade de template Aplicações - Clonagem de fragmentos de DNA por síntese de "cauda" homopolimérica em ambas as extremidades do fragmento de DNA - Marcação de extremidades 3' - Incorporação de nucleótidos não radioactivos (com fluorocromos, por exemplo) - Síntese de homopolímeros 7

8 DNA polimerases dependentes de RNA Transcriptase reversa - Derivada de retrovírus como o AMV (Avian Myeloblastosis Virus) ou MMLV (Moloney Monkey Leukemia Virus) - Cataliza a síntese de cadeias de DNA a partir de um template de RNA, embora também possa usar DNA como template (taxa de polimerização muito baixa). - Também possuem actividade Rnase H, isto é, degradam RNA em híbridos DNA:RNA 8

9 Aplicações - Síntese de cdna - Sequenciação de DNA - Destruição selectiva de partes de uma molécula de RNA (Hibridada com DNA) RNA polimerases dependentes de DNA - Usando promotores apropriados à enzima escolhida, permitem a síntese in vitro de transcritos de mrna - E. coli RNA polimerase - RNA polimerases de fagos (SP6, T7, T3) 9

10 RNA polimerases independentes de DNA - Poli(A) Polimerase - Cataliza a incorporação de AMP na extremidade 3' de RNA sem necessidade de template de DNA Aplicações - Marcação de RNA - Sondas de RNA - Clonagem de RNA sem "cauda" poli-a 10

11 Fosfatases e Cinases - Fosfatase alcalina bacteriana - BAP - "Calf Intestine Phosfatase" - CIP - Catalizam a hidrólise de fosfato 5' de DNA, RNA, ribonucleótidos e desoxirribonucleótidos. Os produtos desfosforilados ficam com uma extremidade 5'-hidroxil Aplicações - Desfosforilação de extremidades 5' de ácidos núcleicos antes da marcação com 32 P - Desfosforilação das extremidades 5' de DNA vectorial para prevenir a auto-ligação do vector 11

12 T4 Cinase - Produto do gene pset - Actividade contrária às fosfatases. Catalisa a adição de fosfato à extremidade 5'-hidroxil de DNA e RNA Aplicações - Mapas de restrição por digestão parcial - Marcação de ácidos núcleicos - Ligação de oligonucleótidos em vectores 12

13 Exonucleases SsExonucleases 5'-3' e 3'-5' - Exonuclease VII - Constituída por duas subunidades - Produto dos genes xsea e xseb de E. coli - Degrada ssdna a partir das extremidades Aplicações - Mapeamento de intrões em DNA genómico 13

14 dsexonucleases 5'-3' - λ Exonuclease - E. coli - T7 Exonuclease Aplicações - Converter dsdna em ssdna para sequenciação - Remoção de extremidades 5' de DNA para conjugar com terminal transferase ds Exonuclease 3'-5' - Exonuclease III - Produto do gene xtha de E. coli 14

15 Endonucleases - BAL 31 nuclease - S1 nuclease Aplicações: - Mapeamento de terminações de mrna - Mapeamento de intrões - Produção de blunt-ends 15

16 - DNAse I Aplicações: - Nick translation - Clonagem de fragmentos aleatórios de dsdna Ribonucleases - Degradam RNA RNAse A - Hidrólise de RNA contaminante em preparações de DNA - Quantificação de RNA por ribonuclease protection assay RNAse H degrada RNA em híbridos DNA:RNA - Facilitar a síntese de cdna - Criar deleções específicas em RNA 16

17 DNA ligases - Catalizam a formação de ligações fosfodiester entre extremidades 3'- hidroxil e 5'-fosfato em dsdna - T4 DNA ligase - Produto do gene 30 do bacteriófago T4 - repara nicks de cadeia simples em DNA de cadeia dupla e liga DNA de cadeia dupla com sticky ou blunt ends 17

18 - E. coli DNA ligase - gene lig - repara nicks de cadeia simples em DNA de cadeia dupla e liga DNA de cadeia dupla com sticky ends. Não funciona com blunt ends 18

19 1- O vector pi possuí três locais de restrição, B, C e E. Descreva a estratégia mais simples para introduzir os inserts 1, 2, 3 e 4 no vector pi. Tenha em consideração os seguintes factos: o insert 2 deve ser mantido na orientação correcta; na ligação do insert 3 o vector pi apresenta um alto índice de auto-ligação; o insert 4 torna-se extremamente ineficiente se o local de restrição D for transformado em blunt end. A, B, C e D sticky end. E blunt end. B E C 1 A A 2 C B C pi 3 B B 4 D B C D 19

20 Clonagem de DNA com inibição da auto-ligação do vector. 20

21 Ligação de fragmentos de DNA com extremidades incompatíveis 21