Análises moleculares - DNA
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- Giovana Zilda Viveiros Fraga
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1 Análises moleculares - DNA
2 Como o mapeamento genético contribui para a genética médica? A caracterização de um gene e suas mutações aumenta a compreensão da doença Aplicações: -Desenvolvimento de diagnóstico específico e sensível por meio da detecção direta das mutações -Identificação do risco do indivíduo em desenvolver a doença ou transmiti-la para seus filhos -Terapias com drogas para prevenir ou aliviar as doenças, ou reduzir sua progressão
3 2 obstáculos para a obtenção de uma quantidade suficiente de uma sequência de DNA ou RNA: Cada célula apresenta duas cópias de um gene e alguns genes são expressos apenas em um subgrupo de tecidos ou em baixos níveis, ou ambos Dificuldade em purificação da sequência em questão a partir de todos os outros segmentos da molécula de DNA ou RNA presentes na célula
4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Processo de replicação do DNA in vitro Amplificação dos fragmentos de DNA Pode gerar grande quantidade de uma sequência de interesse em poucas horas Componentes: -Iniciadores (oligonucleotídeos) -DNA polimerase (enzima + Tampão de reação + MgCl2) -Nucleotídeos (datp, dctp, dgtp, dttp) -DNA molde
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6 Ciclos repetidos de desnaturação pelo calor, hibridização com os iniciadores, e síntese de DNA resultam em uma amplificação exponencial do DNA alvo PCR: aplicação clínica para diagnóstico de doenças Fragmento amplificado Gel de agarose
7 Eletroforese (DNA com carga negativa corre em direção à eletrodo com carga positiva)
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10 PCR / eletroforese e diagnóstico
11 DNA Fingerprint
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13 DNA Fingerprint
14 DNA Fingerprint
15 PCR-RFLP Polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição; Amplificação dos fragmentos de DNA Utiliza enzimas de restrição
16 Sítios de restrição
17 PCR-Multiplex Vários primers específicos em uma mesma reação PCR; Ex: Vários exons Para o gene da distrofina
18 SNP Single nucleotide Polimorphism Polimorfismos de um único nucleotídeo; Amplificação do DNA via PCR e análise em eletroforese a partir do DNA amplificado desnaturado. Serve para detectar polimorfismos em cadeias de DNA.
19 DNA heteroduplex Polimorfismos de um único nucleotídeo; Amplificação de sequências de DNA via PCR, desnaturação das sequências e reanelamento para posterior eletroforese. Serve para detectar polimorfismos em cadeias de DNA. Ex. gel de poliacrilamida para 16S
20 Sequenciamento de DNA Utiliza alguns análogos químicos dos 4 nucleotídeos conhecidos, chamados didesoxinucleotídeos Não apresentam o grupo OH na posição 3` da desoxirribose não permitem extensão da cadeia término da cadeia Cada nucleotídeo marcado com um corante fluorescente diferente Término de cadeia
21 Sequenciador ABI
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23 Eletroferograma
24 Síndrome de Rett Sequenciamento do gene MECP2 verificar ocorrência de mutação no DNA (proteína não será capaz de exercer sua função biológica de forma adequada) causa da síndrome de Rett Sequência de DNA do gene MECP2 TRADUÇÃO
25 Southern blot Técnica que permite localizar uma quantidade de fragmentos de DNA de interesse em meio a fragmentos de DNA clivados por enzimas de restrição Possível determinar se uma mutação em particular está presente ou ausente em um paciente mutação em uma base impossibilita a hibridização por complementariedade de bases (sondas alelo-específicas)
26 Digestão do DNA com enzimas de restrição Isolamento de DNA genômico (linfócitos de sangue, por exemplo) Eletroforese dos fragmentos em gel de agarose Desnaturação do DNA Transferência dos fragmentos do gel para a membrana por capilaridade Hibridização com sonda marcada de fita simples (Condições que proporcionem o pareamento de bases) Exposição da membrana a filmes de raio-x
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29 Detecção de uma deleção do gene receptor de androgênio por Southern Blot indivíduo com insensibilidade ao andrógeno apresenta cariótipo 46,XY, mas fenotipicamente é feminino DNA genômico digerido por enzima de restrição e corado com brometo de etídeo após eletroforese Após Southern Blot e hibridização com uma sonda de cdna para o gene receptor do androgênio
30 Uso de oligonucleotídeos alelo específicos: Detecção anemia falciforme Permite uma identificação exata de uma sequência particular do DNA, onde é possível distinguir homozigotos de heterozigotos
31 FISH (Fluorescence in situ hibridization) Citogeneticistas são capazes de hibridizar as sondas alvo,marcadas com corantes fluorescentes, contidas dentro de cromossomos imobilizados em lâminas de microscopia Visualização de aberrações cromossômicas
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34 Detecção da leucemia mielóide crônica Expansão anormal de células progenitoras hematopoiéticas transformadas, que aumenta o número de células mielóides circulantes Translocação cromossômica que leva a superexpressão do protooncogene BCR-ABL 15% das leucemias CROMOSSOMO PHILADELPHIA: Genes ABL e BCR são rompidos e unidos em um novo cromossomo 22 Abl-bcr: fosforilam muitos substratos, ativando cascatas de sinalização que controlam crescimento e diferenciação proliferação descontrolada de células-tronco hematopoiéticas
35 Gene ABL: cromossomo 9 Gene BCR: cromossomo 22 CROMOSSOMO PHILADELPHIA: verde +vermelho=sinal amarelo
36 Principais indicações de diagnóstico pré-natal Idade materna avançada Filho anterior com aneuploidia cromossômica Presença de anomalia cromossômica estrutural em um dos pais Histórico familiar de um distúrbio genético que pode ser diagnosticado por análises bioquímicas ou de DNA Histórico familiar de um distúrbio ligado ao X Risco de um defeito do tubo neural Triagem do soro materno e exame de ultra-sonografia
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38 Punção de vilosidades coriônicas
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