Drielly Cristina Braite Gabriella Borba Lívia B. Eslabão Luiza P. Rodrigues Tatiane Casarin

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Tomás Valgueiro
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Ferramentas mais rápidas e mais sensíveis,

diagnóstico baseado em técnicas moleculares.

2 Ferramentas mais rápidas e mais sensíveis, de base molecular, são de grande valor. A extração e a purificação de ácidos nucléicos são pontos fundamentais no diagnóstico baseado em técnicas moleculares. Amplificação in vitro de uma seqüência específica de DNA.

4 Variação do PCR onde a reação de amplificação é iniciada a temperaturas elevadas

5 A atividade da Taq DNA polimerase é inibida durante a preparação da reação evitando a amplificação de produtos inespecíficos, melhorando o rendimento da reação.

6 Baixa Especificidade (mispriming)

7 Mix de reação completo (20 a 25 o C) Transferir para termociclador Ciclos Produto amplificado

8 Mix de reação completo (20 a 25 o C) Transferir para termociclador (desnaturação 100 o C e manter a 80 o C) Adicionar Taq polimerase Produto amplificado

9 Trabalho intensivo; Manual: Maior risco de contaminação.

10 Enzima atua em Temperatura IDEAL Permite a inibição da atividade da polimerase durante a preparação da reação AmpliTaqGold. Aumenta: Especificidade, Sensibilidade e Rentabilidade do produto. Medicina Forense Determinação da CAUSA da morte.

Gentilmente vortex e centrifugar brevemente todas as soluções

Coloque em tubo de PCR : 10X TrueStart Hot Start Taq buffer -

Encaminhar primer - 0,1-1 mm Reverse primer - 0,1-1 mm

11 Gentilmente vortex e centrifugar brevemente todas as soluções após o descongelamento. Coloque em tubo de PCR : 10X TrueStart Hot Start Taq buffer - 5 μl dntp Mix, 2 mm de cada - 5 microlitro 25 mm MgCl2-1,2 μl Encaminhar primer - 0,1-1 mm Reverse primer - 0,1-1 mm TrueStart Hot Start Taq DNA polimerase - 0,25-2 u Água, livre de nuclease completar volume O volume total - 50 μl

12 Gentilmente vórtice das amostras e girar para recolher gotas. Condições térmicas e tempo recomendado para cada etapa da reação: Etapa Temperatura, C Tempo, min Número de Ciclos Desnaturação inicial / Ativação Enzimática Desnaturação 95 0,5-1 Recozimento TM-5 0, Extensão 72 1 min / kb Final de Extensão

13 AmpliTaq Gold enzima recombinante forma inativada ativação 10 min 94 o C Platinum Taq Polymerase ligação com inibidor termolábil contendo anticorpo monoclonal

14 Anticorpo Invitrogen Platinum Taq Polipeptídio Eppendorf HotMaster Taq Modificação Química Roche FastStart Taq ABgene ABgene THERMO-START DNA polimerase Stratagene SureStart Taq SABiosciences ReactionReady HotStart "Sweet" PCR master mix

15 A reação de PCR é ativada quando a temperatura atinge 94ºC; Especificidade uma vez em que a Taq DNA Polimerase é ativada quando atinge temperatura IDEAL

16 Barreira física Cera - atua como cápsula; Ligante Inibição Taq DNA Polimerase por Anticorpo e Oligonucleotídeos; Manual Enzima é excluída da mistura e adicionada em Tº Ideal (RISCO: Contaminação cruzada). Modificação química da Polimerase (Ex. TrueHotStart).

18 HOT START PCR Aumenta a Especificidade

Comparação da PCR com a especificidade TrueStart Hot Sart Taq DNA polimerase comercial ou outros sistemas de PCR Hot Start em um alvo complexo.

20 Comparação da PCR com a especificidade TrueStart Hot Sart Taq DNA polimerase comercial ou outros sistemas de PCR Hot Start em um alvo complexo. Um fragmento de DNA de 2kb do gene da beta-globina humana foi ampliado de acordo com as recomendações do fabricante. M CONTROLE (Plus 100 pb DNA Ladder Gene Ruler) 02/01 True Start Hot Start: Taq DNA polimerase (modificação química por um ligante); 04/03 Vendedor A: Taq DNA polimerase (modificação química); 06/05 Vendedor B: Taq DNA polimerase (dependentes de inibidores de temperatura); 08/07 Vendedor C: Taq DNA polimerase (baseado em anticorpos); 10/09 Ferramentas: Taq DNA polimerase (não arranque a quente).

21 Aplicações PCR Hot Start

22 Hot start Especificidade Sensibilidade Rentabilidade do Produto

23 Utilização de barreira física cera na Taq DNA Polimerase

24 Utilização de Inibidores - Oligonucleótídeos

25 Utilização de RT-HOT START PCR Transcrição reversa HOT START PCR

28 Associa hibridização In Situ e PCR Além dos primers específicos para a sequência de DNA e dos reagentes próprios para PCR, um dos nucleotídeos adicionados é marcado com biotina para a detecção do local onde haverá fragmentos de DNA, se houver amplificação.

29 Permite a localização de sequências de células específicas dentro de populações de células, como tecidos e amostras de sangue. Detectar DNA viral, proviral, rearranjos do DNA e translocações. Pode detectar quantidades pequenas de DNA.

30 Tempo de alongamento do DNA é maior, devido à dificuldade da barreira física de uma célula fixada.

32 PCR In Situ incorporação direta do nucleotídeo repórter no produto da PCR, durante a síntese. RT In Situ PCR incorporação direta do nucleotídeo repórter no cdna amplificado. PCR Hibridização In Situ o produto da PCR é marcado com uma sonda, depois da síntese, utilizando um passo de hibridização.

34 Protocolo - In Situ PCR

35 Amostras de tecido Formalina tamponada e parafina Cultura de células PBS e formalina tamponada

36 Lâminas devem ser revestidas com silano. Elas são colocadas em xileno fresco para a remoção da parafina.

37 Pepsina, tripsina ou proteinase K. Funções: Permitir a entrada da sonda / primer / Taq polimerase; Exposição do DNA.

Para cada lâmina, preparar 25 l de solução: 2.5 l de PCR buffer 4.5 l de MgCl 2 (25 mm solução estoque) 4.0 l de solução dntp (200 M concentração final de cada nucleotídeo) 1.

38 Para cada lâmina, preparar 25 l de solução: 2.5 l de PCR buffer 4.5 l de MgCl 2 (25 mm solução estoque) 4.0 l de solução dntp (200 M concentração final de cada nucleotídeo) 1.0 l de albumina de soro bovino 2% (BSA) 0.4 l de solução dutp digoxigenina (1 mm solução estoque) 1 l de cada um dos primers: primer 1 and primer 2 (20 M) 11 l de água 0.5 l de Taq polimerase

39 RT In Situ PCR

40 É a combinação entre a PCR In Situ e a transcrição reversa. Ela difere da PCR In Situ normal em dois passos: na digestão com DNase e na etapa de transcrição reversa.

41 PREPARAÇÃO DA AMOSTRA, FIXAÇÃO, INCORPORAÇÃO DA PARAFINA, PREPARAÇÃO DO CORTE, REMOÇÃO DA PARAFINA E DESIDRATAÇÃO DIGESTÃO PROTEOLÍTICA IN SITU RT IN SITU DIGESTÃO COM DNase PCR RT

43 Detecções de viroses que possuem o genoma composto por RNA, por exemplo, hepatite C; Detecção de mrnas humanos.

44 PCR Hibridização In Situ

46 PCR In Situ 15 ciclos a 94ºC em 1 min. PCR Hibridização In Situ 35 ciclos a 94ºC em 1 min.

47 São moléculas de DNA de fita simples, de pequeno tamanho, que estão marcadas com uma substância radioativa ou com uma substância qualquer que permitam suas visualizações no final da hibridização.

48 Radioativos nucleotídeos contendo radioisótopos ( 32 P, 33 P, 35 S ou 3 H); Não radioativos fluoróforo, enzima, molécula repórter (biotina, digoxigenina).

49 Aplicações PCR In Situ

51 PCR in situ e hibridização 7 pacientes soropositivos e 8 soronegativos Células do sangue fixadas com acetona Padrão de positividade em 6 soropositivos e em todos os soronegativos PCR in situ consegue distinguir qual o tipo e quantas células hospedam o vírus

53 10 amostras de tecidos pulmonar, sendo que 3 não apresentavam pneumonia Embebidos em parafina Primers para Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus e Streptococcus equisimilis Em 7 casos foram encontrados uma das 3 bactérias Genoma bacteriano encontrado no citoplasma de leucócitos PCR in situ identificou bactérias em tecidos

55 Importante para a criação de animais de produção Detecção da co-infecção pelo Coronavírus grupo 3 e Astrovírus Primers da região do vírus IBV, semelhante ao genoma do Coronavírus Lâminas com porções de intestino, íleo, bursa, timo, baço, ceco para técnica de RT PCRT in situ Associa análises morfológicas e moleculares

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