Instruções de Uso XGEN RNA REFERÊNCIA/p210 Kit de RNA Referência para Quantificação de cdna de BCR/ABL p210

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1 Instruções de Uso XGEN RNA REFERÊNCIA/p210 Kit de RNA Referência para Quantificação de cdna de BCR/ABL p USO PRETENDIDO O kit XGEN RNA REFERÊNCIA/p210 é destinado para a avaliação de desempenho do ensaio quantitativo para detecção do transcrito do gene BCR/ABL p210, normalizado com os transcritos do gene controle (ABL), e para o cálculo do Fator de Conversão (CF) necessário para expressar os dados da quantificação final de BCR/ABL p210 na Escala Internacional (IS). PRODUTO DESTINADO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO 2. INTRODUÇÃO O produto é uma mistura de RNA total contendo transcritos BCR/ABL em diferentes proporções, que pode ser diretamente aplicado à reação de transcrição reversa e amplificação do cdna, através do sistema quantitativo utilizado no laboratório. O kit permite calcular o Fator de Conversão teórico que é essencial para a padronização do ensaio quantitativo para BCR/ABL em casos de Leucemia Mielóide Crônica (LMC), Leucemia Mielóide Aguda (LMA) e Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) e durante o monitoramento da Doença Residual Mínima. O kit fornece quatro tubos de RNA total extraído a partir da mistura de duas linhas de células humanas em proporções diferentes. Cada solução foi obtida por diluição conhecida de quantidades de células positivas para a translocação (9; 22), rearranjo BCR/ABL, variante de p210, em quantidades conhecidas de células que não apresentam a translocação de interesse. 3. PRINCÍPIO DO TESTE O kit XGEN RNA REFERÊNCIA/p210 consiste em RNA total extraído a partir de misturas de células que permite quantificar o transcrito BCR/ABL p210 e ABL, através da tecnologia de PCR em Tempo Real. Recomenda-se a utilização do kit XGEN RNA REFERÊNCIA/p210 em conjunto com o ensaio de amplificação One-Step kit XGEN MIX p COMPONENTES O formato padrão do kit contém reagentes para: 6 sessões de análise, utilizando em conjunto com o produto kit XGEN MIX p210. Cada sessão inclui duas reações para BCR/ABL p210 e duas reações para ABL para cada amostra. Cada reação deverá ser realizada com 500 ng de RNA. Neste caso, será necessário ajustar a concentração do RNA a ser utilizado para 100 ng/μl e, em seguida, utilizar 5 μl na reação (equivalente a 500 ng de RNA Total). 12 sessões de análise, quando se utiliza a tecnologia de PCR em Tempo Real com a metodologia de Two-Steps. O volume de 2,5 μl de cada ponto de diluição (correspondente a 1 μg de RNA Total) pode ser utilizado para cada reação de transcrição reversa. 1

2 COMPONENTES CONTEÚDO QUANTIDADE RNA REF 0,01% com: 0,01% - Células p Microtubo/30 μl 99,99% - Células p210 - RNA REF 0,1% com: 0,1% - Células p Microtubo/30 μl 99,9% - Células p210 - RNA REF 1% com: 1% - Células p Microtubo/30 μl 99% - Células p210 - RNA REF 10% com: 10% - Células p Microtubo/30 μl 90% - Células p210 - Guia Rápido Guia Rápido 1 unidade 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE Armazenar o kit XGEN RNA REFERÊNCIA/p210 em freezer a temperatura constante entre -80 C a -70 C. Mais de dois ciclos de congelamento e descongelamento podem reduzir o desempenho do produto, por isso recomenda-se realizar alíquotas do reagente após o primeiro descongelamento. Armazenar todos os componentes do kit em recipientes originais. Os componentes armazenados sob outras condições que não as especificadas no rótulo podem não proporcionar um desempenho correto, afetando negativamente os resultados dos testes. O kit permanecerá estável e manterá seu desempenho até a data de validade impressa no rótulo sob as condições de armazenamento corretas. 6. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS Avaliar a necessidade de incluir ou retirar itens da lista abaixo. Cabine de Fluxo Laminar; Luvas Descartáveis Sem Talco; Agitador Tipo Vórtex; Microcentrífuga ( rpm); Micropipetas; Ponteiras Estéreis com Filtro; Termociclador para PCR em Tempo Real. OBSERVAÇÃO: No caso do produto não ser utilizado em conjunto com o kit XGEN MIX p210, é necessário providenciar o kit para a reação de transcriptase reversa do RNA, o kit para amplificação do alvo desejado e a microplaca de reação. 7. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado. 2. O pessoal técnico deve ser treinado no uso dos termocicladores em Tempo Real, na manipulação de reagentes de biologia molecular e qualificados em protocolos de amplificação de PCR em Tempo Real. 3. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar equipamentos de proteção individual. O uso de objetos perfuro-cortantes deve ser evitado. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor. 4. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados contra tétano, difteria, hepatite B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com a Norma Regulamentadora O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar. 6. Evitar vibração na superfície da bancada onde o teste é realizado. 2

3 7. Após o recebimento, armazenar o kit entre -80 C e -70 C em freezer com temperatura controlada. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits. Recomenda-se que os componentes entre dois kits do mesmo lote também não sejam trocados. 8. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis pesadas ou grumos. Caso contrário, comunicar o supervisor do laboratório para iniciar os procedimentos necessários para reposição do kit. 9. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada pipetagem. 10. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada pipetagem. 11. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta externa. 12. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as amostras de soro humano, sangue, plasma devem ser manuseadas em Nível de Biossegurança II, como recomendado pela legislação em vigor. 13. Armazenar e extrair as amostras separadamente de outros reagentes e utilizar sala dedicada para o manuseio. 14. Realizar os procedimentos o mais rápido possível, mantendo os componentes no gelo ou em reservatório refrigerado. 15. O fluxo de trabalho no laboratório deve proceder de maneira unidirecional, começando na área de extração e passando para a amplificação e área de análises de dados. Não retornar as amostras, equipamentos e reagentes para a área onde as primeiras etapas foram realizadas. 16. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos componentes líquidos ou na transferência dos componentes para sistemas automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada. 17. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados, de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor. 18. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das amostras devem ser absorvidos por lenços de papel umedecidos com hipoclorito, e em seguida, com água. 19. Outros resíduos gerados devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados, de acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais. 8. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS RNA REF 0,01% / 0,1% / 1% / 10% Solução concentrada de 400 ng/μl. Ajustar a concentração de cada tubo de RNA para 100 ng/μl, dessa forma, adicionar 90 μl de água destilada livre de RNAse e DNAse (recomenda-se a utilização do reagente da marca SIGMA Catálogo ). Descongelar a quantidade necessária, homogeneizar cuidadosamente em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar todo o conteúdo no fundo do tubo. Utilizar 5 μl na reação (equivalente a 500 ng de RNA total). 9. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O KIT Micropipetas Devem ser calibradas para distribuir o volume correto necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações das partes que podem acidentalmente entrar em contato com a amostra. Elas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de mostrar precisão de 1% e exatidão de +/- 5%. 3

4 12. Para utilização do kit em outros equipamentos deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 10. CONTROLE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES 1. Verificar a data de validade do kit impresso na etiqueta externa da caixa do kit. 2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por partículas visíveis a olho nu ou grumos. Verificar se há ruptura na caixa de transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa. 3. Ligar o termociclador, verificar as configurações e certificar-se de utilizar o protocolo de ensaio correto. 4. Seguir estritamente o manual do equipamento fornecido pelo fabricante para a correta configuração do termociclador em Tempo Real. 5. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume necessário. 6. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso. 7. Em caso de problemas, não continuar o teste e comunicar ao responsável pelo laboratório. 11. PROTOCOLO Os reagentes são prontos para uso. Após seguir as instruções do item 8, deve-se adicionar a solução à mistura de amplificação. Para uma corrida analítica, 5 µl do reagente é suficiente, utilizando em conjunto com o KIT XGEN MIX p210. CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO É recomendado realizar o teste em duplicata, para cada uma das quatro concentrações de RNA, tanto para o gene alvo BCR/ABL p210 e como para o gene controle ABL. OBSERVAÇÃO: No caso do kit XGEN RNA REFERÊNCIA/p210 não ser utilizado em conjunto com o KIT XGEN MIX p210, é necessário seguir as instruções de uso do fornecedor do kit de Transcriptase Reversa do RNA e do kit para amplificação. É recomendado utilizar o kit XGEN RNA REFERÊNCIA/p210 idealmente em cada sessão ou pelo menos uma vez a cada três meses e sempre que ocorrer mudança no procedimento de monitoramento da doença residual mínima como calibração de equipamentos, mudanças no kit de quantificação, mudança de operador, mudanças no fluxo de trabalho do laboratório. Após a etapa de amplificação, o título calculado de cada tubo de RNA referência do kit tem que ser determinado pelo cálculo da média dos valores da replicata de cada concentração. O fator de conversão será o resultado da média das razões entre cada título de RNA referência (fornecido de acordo com o lote) e o título calculado de cada tubo RNA referência. CÁLCULO DO FATOR DE CONVERSÃO O cálculo do fator de conversão (FC) é a média da razão de cada solução de RNA Referência e os valores de amplificação obtidos para cada concentração. Para cada solução de RNA Referência amplificado, calcular a razão de transcritos BCR-ABL p210 (razão entre o número de cópias de transcritos de BCR-ABL p210 e transcritos ABL) de cada replicata. 4

5 O fator de conversão será o resultado da média da razão entre cada título de RNA referência e o título calculado para cada tubo. ATENÇÃO: Para a realização dos cálculos, consultar o informativo disponível no site correspondente ao lote que está sendo utilizado. 13. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS Interpretação dos resultados deve ser feita sob a supervisão do responsável do laboratório para reduzir o risco de erros e resultados mal interpretados. Quando os resultados do laboratório são transmitidos do laboratório para o centro de informática, deve-se prestar muita atenção para evitar erro na transferência de dados. Recomenda-se informar qualquer problema residual ao supervisor para futuras ações. 14. LIMITAÇÕES Para o usuário deste kit recomenda-se a leitura cuidadosa e a compreensão da instrução de uso. A adesão estrita ao protocolo é necessária para a obtenção de resultados confiáveis. Em particular, a veracidade da amostra, a pipetagem de reagentes, a aplicação de fluxo de trabalho correto, juntamente com a etapa da programação cuidadosa do termociclador, é essencial para resultados precisos e reprodutíveis. 15. GARANTIA DA QUALIDADE A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos seguintes termos. GARANTIA O produto XGEN RNA REFERÊNCIA/p210 é garantido pela Mobius contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta. A garantia abrange defeitos de produção. EXCEÇÕES NA GARANTIA Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem inadequada. EXTINÇÃO DA GARANTIA Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação. 16. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Mobius Life Science Comércio de Produto para Laboratórios Ltda. Rua Paraíso do Norte, 866. CEP: Pinhais/PR BRASIL Fone: Fax: info@mobiuslife.com.br CNPJ: / REGISTRO ANVISA RESPONSÁVEL TÉCNICA Flávia Rosenstein Schiel CRBio /07-D Website: 5

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