Instruções de Uso Kit XGEN MASTER MTB Kit Master para Detecção de DNA de Mycobacterium tuberculosis 1. USO PRETENDIDO
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- Mikaela Osório Castilhos
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1 1. USO PRETENDIDO Instruções de Uso Kit XGEN MASTER MTB Kit Master para Detecção de DNA de Mycobacterium tuberculosis O Kit XGEN MASTER MTB é destinado para a detecção qualitativa do DNA de Mycobacterium tuberculosis (MTB) em amostra clínicas de escarro, lavado bronco alveolar, líquido cefalorraquidiano, tecidos, nódulos linfáticos, medula óssea, fezes e lavagem gástrica, com controle simultâneo de reação de extração/amplificação através do Controle Interno (CI). O Kit XGEN MASTER MTB é direcionado para uso em combinação com os Termocicladores ABI Sequence Detection System 7300 (Software SDS Version 1.4, Applied Biosystems *) e 7500 (Software SDS Version 1.3.1, Applied Biosystems *). PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO. 2. INTRODUÇÃO Mycobacterium tuberculosis (MTB) é o agente causador de uma grave doença respiratória, a tuberculose (TB). Atualmente esta doença cresce significativamente devido à ocorrência de cepas multirresistentes, ao crescente número de pacientes imunodeficientes e às taxas crescentes de migração da população. A infecção pela MTB ocorre principalmente nos pulmões e pode ser detectada em amostras de escarro, lavado bronco alveolar (LBA) e biópsias do pulmão. Infecções também podem aparecer em locais atípicos causando meningite basilar, tuberculose gangliforme, infecções urogenitais, infecções nas articulações e infecções nos olhos. Os testes clássicos designados para o diagnóstico da tuberculose são baseados na coloração acidófila do MTB e microscopias, acompanhadas por uma cultura para confirmação. Estes métodos tradicionais além de requererem bastante tempo (a cultura, por exemplo, necessita de 2 a 4 semanas), possuem uma baixa sensibilidade. Portanto, as metodologias baseadas em PCR são rápidas e sensíveis, tornando-se gradativamente procedimentos padronizados para o diagnóstico da tuberculose. Estes métodos são capazes de registrar pequenas quantidades de patógeno em ampla diversidade de material clínico. O resultado positivo do exame de detecção de Mycobacterium tuberculosis por PCR deve ser considerado apenas como prova da doença. A detecção pelo método molecular pode ser negativa em casos de localização extrapulmonar, estado latente do portador ou devido à amostra clínica inadequada. IMPORTANTE: A presença de bactérias mortas após a terapia anti-tb deve ser levada em conta na interpretação dos resultados de PCR. Além disso, detecções positivas (em qualquer tipo de amostra) em pacientes idosos, assintomáticos e/ou infectados latentes, podem ser representativas de MTB presentes em quantidades muito baixas que não reagem a qualquer tipo de tratamento. 3. PRINCÍPIO DO TESTE O Kit XGEN MASTER MTB detecta especificamente cepas do complexo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum e M. microti) e também cepas de vacinas (por exemplo: BCG). A presença de M. tuberculosis é indicada pelo aumento da fluorescência do fluoróforo FAM. O Controle Interno, detectado no canal de fluorescência do fluoróforo HEX/JOE, é incluído no processo de extração de DNA, controlando uma possível inibição da reação de PCR. O kit de detecção aproveita a tecnologia "hot start", minimizando reações não específicas e garantindo a máxima sensibilidade. A MasterMix é pronta para o uso e contém Uracilo-DNA-Glicosilase (UDG), eliminando possíveis contaminações da reação de PCR por produtos de amplificação. O Kit XGEN MASTER MTB oferece 16 vezes mais sensibilidade em exames de diagnósticos quando comparado às técnicas convencionais. 1
2 Gene Alvo Inserção Específica de Múltiplas Cópias da Sequência IS6110 Complexo Mycobacterium tuberculosis Especificidade (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum e M. microti) e também cepas de vacina BCG. Sensibilidade (LOD) 0,06 genomas/µl com probabilidade de 95%. 4. COMPONENTES O formato padrão contém reagentes para 100 testes. COMPONENTES CONTEÚDO QUANTIDADE MM MTB Solução Master Mix de Amplificação 4 x 750 µl CP MTB Controle Positivo 10 2 cópias/µl de Mycobacterium tuberculosis 2 x 200 µl CI MTB Controle Interno 2 x µl CN Controle negativo 1 x 500 µl 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O Kit XGEN MASTER MTB deve ser armazenado entre -20 C e -80 C. O produto estocado corretamente é estável até a data de validade impressa no rótulo. Repetidos ciclos de congelamento e descongelamento da MasterMix, do Controle Interno e do Controle Positivo devem ser evitados, pois podem resultar em uma baixa qualidade de detecção. Sendo assim, recomenda-se fazer a alíquotas de 30 µl da MasterMix em tubos para PCR livres de DNAse e RNAse e mantê-las armazenadas entre -80 C a -20 C. O Kit quando em uso, apresenta uma estabilidade de até 6 horas a temperatura ambiente e em condições de luz normal. Minimizar a exposição à luz dos componentes do kit. Os componentes armazenados sob outras condições que não as especificadas no rótulo podem não proporcionar um desempenho correto, afetando negativamente os resultados dos testes. 6. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS Micropipetas calibradas (0,5 µl < volume < µl); Microcentrífuga; Racks para tubos; Ponteiras estéreis com filtro; Microtubos livres de Nuclease; Microtubos de 0,2 ml ou Microplacas de PCR, recomendados pelo fabricante do equipamento de PCR em Tempo Real; Luvas descartáveis sem talco; Termociclador* para PCR em Tempo Real; Agitador tipo Vórtex ou similar; (*) Atenção: Uma calibração válida dos corantes puros (Pure Spectra Component File) e do background (Background Component File) deve ser feita rotineiramente. 7. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado. 2. O pessoal técnico deve ser profundamente treinado no uso dos termocicladores em Tempo Real, na manipulação de reagentes de biologia molecular e qualificados em protocolos de amplificação de PCR em Tempo Real. 3. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar equipamentos de proteção individual. O uso de objetos perfuro-cortantes deve ser evitado. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor. 2
3 4. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados contra tétano, difteria, hepatite B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com a Norma Regulamentadora O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar. 6. Evitar vibração na superfície da bancada onde o teste é realizado. 7. Após o recebimento, armazenar o kit entre -20 C e -80 C, em um freezer ou câmara fria com temperatura controlada. 8. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits. Recomenda-se que os componentes entre dois kits do mesmo lote também não sejam trocados. 9. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis pesadas ou grumos. Caso contrário, comunicar o supervisor do laboratório para iniciar os procedimentos necessários para reposição do kit. 10. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada amostra. 11. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as entre o uso de cada uma. 12. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta externa. 13. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as amostras de soro humano, sangue, plasma devem ser manuseadas em Nível de Biossegurança 2, como recomendado pela legislação em vigor. 14. Armazenar e extrair as amostras separadamente de outros reagentes e utilizar sala dedicada para o manuseio. IMPORTANTE: Para obtenção de resultados satisfatórios é imprescindível à utilização de um kit de extração recomendado para extração de DNA de Mycobacterium tuberculosis devido às características da bactéria. 15. Realizar os procedimentos o mais rápido possível, mantendo os componentes no gelo ou em reservatório refrigerado. 16. O fluxo de trabalho no laboratório deve proceder de maneira unidirecional, começando na área de extração e passando para a amplificação e área de análises de dados. Não retornar as amostras, equipamentos e reagentes para a área onde as primeiras etapas foram realizadas. 17. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos componentes líquidos ou na transferência dos componentes para sistemas automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada. 18. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor. 19. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das amostras devem ser absorvidos por lenços de papel umedecidos com hipoclorito, e em seguida, com água. 20. Outros resíduos gerados (exemplo: ponteiras usadas para amostras) devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados de acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais. 8. AMOSTRAS: PREPARAÇÃO E RECOMENDAÇÕES Usualmente são utilizadas amostras do trato respiratório para diagnosticar a presença de M. tuberculosis. Geralmente a infecção não é disseminada, portanto a detecção em amostras de sangue periférico não é importante para fins de diagnósticos. Amostras de escarro, lavado bronco alveolar, aspirados da traqueia e brônquios, ou eventualmente biópsias pulmonares (cerca de 1g), urina (jato médio da primeira urina da manhã), úlceras de pele, pus, conteúdo de abscessos ou fluidos sinoviais devem ser colhidas de forma estéril e em um tubo sem qualquer meio de transporte. Armazenar e transportar à temperatura entre +2 C a +8 C durante 48 horas. Se for necessário um período de armazenamento mais longo, congelar a amostra entre -20 C a -80 C. IMPORTANTE: Para utilização do kit com outras amostras deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 3
4 9. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS Os componentes do Kit XGEN MASTER MTB são prontos para o uso. A extração do DNA deve ser realizada por kits específicos disponíveis no mercado de acordo com os protocolos específicos para extração particular de MTB. Deve-se adicionar o Controle Interno diretamente na amostra no início do processo de extração. Ao final do processo, deverá conter 0,1 µl do Controle Interno em 1 µl de Volume de Eluição. Volume de Eluição 25 µl 50 µl 100 µl 200 µl Volume de Controle Interno 2,5 µl 5 µl 10 µl 20 µl IMPORTANTE: O valor de Ct do Controle Interno é usado para avaliar se o procedimento de extração foi realizado 10. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O KIT 1. Micropipetas As micropipetas devem estar calibradas para distribuir o volume correto necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações das partes que podem acidentalmente entrar em contato com a amostra. Elas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de mostrar precisão de 1% e uma exatidão de +/- 5%. 2. Termociclador em Tempo Real O Kit XGEN MASTER MTB é direcionado para uso em combinação somente com os Termocicladores ABI Sequence Detection System 7300 (Software SDS Versão 1.4) e 7500 (Software SDS Versão 1.3.1) da Applied Biosystems. Os usuários finais devem seguir estritamente a instrução de uso fornecida pelo fabricante. Para utilização do kit em outros equipamentos deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 11. CONTROLE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES 1. Verificar a data de validade do kit impresso na etiqueta externa da caixa do kit. 2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por partículas visíveis a olho nu ou grumos. Observar se há ruptura na caixa de transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa. 3. Ligar o termociclador e verificar as configurações, conferir se está utilizando o protocolo de ensaio correto. 4. Seguir estritamente o manual do equipamento fornecidos pelo fabricante para a correta configuração do termociclador em Tempo Real. 5. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume necessário. 6. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso. 7. Em caso de problemas, não continuar o teste e comunicar ao supervisor. 12. PROTOCOLO IMPORTANTE: Um exemplo de gabarito para dispensação dos reagentes é informado no item Gabarito do Teste. Favor consultar o item antes de começar a ler as instruções abaixo. NOTA IMPORTANTE: Utilizar somente microtubos e microplacas recomendadas pelos fabricantes de termocicladores em Tempo Real. CONTROLES DE AMPLIFICAÇÃO É obrigatório validar cada sessão de amplificação com reações de controle negativo e controle positivo. 4
5 MONTAGEM DA REAÇÃO IMPORTANTE: manter todos os componentes entre 0 C a +6 C durante o processo de preparação da PCR. 1. Adicionar 30 µl da MasterMix em cada tubo de reação ou nos poços da microplaca. 2. Adicionar 10 µl da AMOSTRA, CP e CN em cada tubo ou poço de reação. OBS: O volume final da mistura será de 40 µl. 3. Fechar os microtubos ou selar a microplaca. 4. Centrifugar brevemente os microtubos ou a microplaca a x g. 5. Colocar os microtubos ou a microplaca no termociclador de PCR em Tempo Real. 6. Configurar os microtubos ou a microplaca no termociclador de PCR em Tempo Real. IMPORTANTE: Cuidado ao manipular o Controle Positivo e o material clínico. O manuseio incorreto pode resultar em contaminação e consequente comprometimento dos componentes do kit. Programação da PCR A programação deve ser feita conforme descrito abaixo. Fase Temperatura Tempo # Ciclos Descontaminação UDG 37 C 2 min 1 Desnaturação inicial 95 C 10 min 1 IMPORTANTE: Configure o equipamento com a correta programação da PCR seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Seleção de Detectores Selecionar os detectores informados na tabela abaixo, conforme o manual de instrução do equipamento a ser utilizado. 13. GABARITO DE TESTE Detecção Repórter Quencher MTB FAM Não Fluorescente Controle Interno (CI) HEX/JOE Não Fluorescente Referência Passiva ROX Não Presente Exemplo de gabarito para posicionamento das amostras e reagentes para uma análise qualitativa. A B C D E F G H A1 A2 A3 A4 A5 CP CN Legenda: A1 a A5 = Amostras; CP = Controle Positivo; CN = Controle Negativo. Desnaturação 95 C 5 seg Anelamento (*Coleta de Dados) 60 C (*) 40 seg Extensão 72 C 20 seg CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO Configurações de Pré-Análise Definir BASELINE, de acordo com as informações abaixo. 5
6 ABI TM PRISM 7300 SDS ABI TM PRISM 7500 SDS BASELINE 03 a 12 Configurar manualmente o THRESHOLD, de acordo com as informações abaixo. Análises de Dados THRESHOLD FAM E HEX/JOE ABI TM PRISM 7300 SDS 0,1 ABI TM PRISM 7500 SDS 0,001 Uma verificação é realizada nos controles sempre que o kit é utilizado a fim de verificar se os valores de Ct são os esperados e informados na tabela abaixo. Verificar ABI TM PRISM 7300/7500 SDS Exigências CP MTB Ct FAM < 45 CN Ct FAM e HEX/JOE Indeterminado * Alta concentração inicial de DNA MTB (Sinal de FAM Positivo) pode levar a um sinal fluorescente REDUZIDO ou AUSENTE do Controle Interno devido à competição entre os reagentes. ** Nestes casos podem ocorrer problemas durante a etapa de amplificação (ineficiência ou ausência de amplificação) ou durante a etapa de extração (presença de inibidores ou amostras iniciais contendo número insuficiente de células), o qual pode levar a resultados incorretos e falsos negativos. O procedimento deve ser repetido iniciando a partir da etapa de extração usando amostra fresca vinda do paciente. IMPORTANTE: devido à alta sensibilidade do Kit MASTER MTB, recomenda-se a avaliação cuidadosa das amostras positivas. Os resultados obtidos devem ser interpretados pelos responsáveis do laboratório levando em consideração os sintomas clínicos dos pacientes e outros parâmetros de laboratório relacionados às condições do paciente. 15. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS PARA CONTROLES Controle Negativo com Presença de Fluorescência Para cada amostra o repórter fluorescente FAM e HEX/JOE são adotados para validar a detecção de DNA de Mycobacterium tuberculosis como descrito na tabela abaixo. Ct FAM Ct HEX/JOE Resultado do Ensaio DETERMINADO E Ct < 45 INDETERMINADO Ct < 45 INDETERMINADO Ct < 38 Ct > 38 ou INDETERMINADO POSTIVO, VÁLIDO POSITIVO, VÁLIDO* NEGATIVO, VÁLIDO INVÁLIDO** CAUSA PROVÁVEL Contaminação durante a pipetagem do controle positivo ou de amostra. AÇÃO CORRETIVA RECOMENDADA Usar somente micropipetas e ponteiras estéreis e com filtro. Sempre trocar a ponteira entre aplicação das amostras. Limpar as superfícies e instrumentos Pipetar o controle positivo no final do procedimento de preparação. Pipetar o controle negativo no início do procedimento de preparação. 6
7 Contaminação do Mix de amplificação. Não dispensar o Mix de amplificação com as mesmas pipetas utilizadas nas áreas de extração. Usar somente micropipetas com ponteiras estéreis e com filtros. Limpar as superfícies e instrumentos Após o uso do Mix de amplificação, tampar e retornar ao freezer antes de abrir outros tubos com amostras. Erro na temperatura dos ciclos. Mix de amplificação mantido por muito tempo em temperatura ambiente. Conferir as configurações de temperatura dos ciclos. Deixar o Mix de amplificação no gelo durante o procedimento e guarde-o imediatamente no freezer -20 C após o uso Mau posicionamento da microplaca. Erro durante a escolha da placa ou do instrumento. Contaminação da área dedicada aos passos de amplificação. CAUSA PROVÁVEL Possíveis erros de pipetagem do controle positivo. Degradação do controle positivo. Amplificação Incorreta do Controle Positivo Posicionar a microplaca cuidadosamente. Checar a placa e as configurações do instrumento. Checar o posicionamento das amostras e controles na placa. Limpar as superfícies e instrumentos Usar jalecos. AÇÃO CORRETIVA RECOMENDADA Pipetar cuidadosamente o controle positivo. Conferir a calibração das micropipetas utilizadas. Verificar a quantidade pipetada de acordo com o procedimento. Testar um novo lote de controle positivo. Amostra Desconhecida Amostra Desconhecida FAM HEX/ JOE + +/- - - PARA AMOSTRAS CLÍNICAS Resultado RESULTADO CORRETO Positivo Atenção: Possibilidade de: Inibição, erro no procedimento ou mau funcionamento do equipamento. Verificar Importante: Alta concentração de DNA MTB (Sinal FAM Positivo) pode levar a um Sinal Fluorescente REDUZIDO ou AUSENTE do Controle Interno devido à competição dos reagentes. 1. Se os componentes foram preparados 2. Se nenhum erro foi realizado no procedimento do ensaio. 3. Se as seleções dos corantes estão corretas, FAM para detecção de MTB e HEX/JOE para detecção do CI. 4. Se as análises foram realizadas com a configuração correta do Equipamento. 5. Se o kit foi armazenado 6. Se nenhum dos potenciais inibidores de PCR contaminaram os tubos. 7. Se o procedimento de 7
8 Amostra Desconhecida - + CP MTB + +/- CP MTB - +/- CN - + CN + +/- RESULTADO CORRETO Negativo RESULTADO CORRETO Atenção: Possibilidade de erro de pipetagem, erro no procedimento ou degradação do controle positivo RESULTADO CORRETO Atenção: Possibilidade de contaminação extração foi executado NA Importante: Alta concentração de DNA MTB (Sinal FAM Positivo) pode levar a um Sinal Fluorescente REDUZIDO ou AUSENTE do Controle Interno C.I devido à competição dos reagentes. 1. Se os componentes foram preparados 2. Se nenhum erro foi realizado no procedimento do ensaio. 3. Se as seleções dos corantes estão corretas, FAM para detecção de MTB e HEX/JOE para detecção do CI. 4. Se as análises foram realizadas com a configuração correta do Equipamento. 5. Se o kit foi armazenado 6. Se nenhum dos potenciais inibidores de PCR contaminaram os tubos. NA 1. Se os componentes foram preparados 2. Se nenhum erro foi realizado no procedimento do ensaio. 3. Se a área de trabalho e os equipamentos são desconta minados regularmente. 4. Se o kit foi armazenado IMPORTANTE: A interpretação dos resultados deve ser feita sob a supervisão do responsável do laboratório para reduzir o risco de erros e resultados mal interpretados. Quando os resultados do laboratório são transmitidos do laboratório para o centro de informática, deve se prestar muita atenção para evitar erro na transferência de dados. Se um ou mais dos problemas descritos na tabela acima acontecer, depois de verificá-los, informar qualquer problema residual ao supervisor para futuras ações. 16. LIMITAÇÕES Para o usuário deste kit recomenda-se a leitura cuidadosa e a compreensão da bula. A adesão estrita ao protocolo é necessária para a obtenção de resultados confiáveis. Em particular, a veracidade da amostra, a pipetagem de reagentes, a aplicação de um fluxo de trabalho correto, juntamente com a etapa da programação cuidadosa do termociclador, é essencial para a detecção de DNA MTB precisa e reprodutível. A determinação do DNA MTB em uma amostra do paciente tem implicações médicas, sociais, psicológicas e econômicas. É recomendado que a confidencialidade, aconselhamento apropriado e avaliação médica sejam considerados aspectos essenciais na sequência de testes. 8
9 17. GARANTIA DA QUALIDADE A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos seguintes termos: GARANTIA O produto Kit XGEN MASTER MTB é garantido pela Mobius contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta. A garantia abrange defeitos de produção. 20. RESPONSÁVEL TÉCNICA Flávia Rosenstein Schiel CRBio /07-D EXCEÇÕES NA GARANTIA Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem inadequada. EXTINÇÃO DA GARANTIA Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação. 18. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Mobius Life Science Comércio de Produto para Laboratórios Ltda. Rua Paraíso do Norte, 866 Pinhais PR - CEP: Tel: (41) info@mobiuslife.com.br Website: CNPJ: / REGISTRO ANVISA
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