BIOPUR KIT Extração Mini Mag SLNB96

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1 BIOPUR KIT Extração Mini Mag SLNB96 Instruções de Uso 1. USO PRETENDIDO O BIOPUR Kit Mini Mag SLNB96 é destinado para extração de DNA genômico de alta qualidade a partir de 200µl de sangue total. O procedimento é baseado na adsorção reversível de ácidos nucleicos em beads magnéticas sob condições de tampões apropriados. A lise das amostras acontece por incubação com o Tampão de lise A, contendo íons caotrópicos e com auxilio de digestão da Proteinase K. Para a ligação dos ácidos nucleicos às beads magnéticas, o tampão de ligação A e as beads magnéticas são adicionados ao produto da lise. Após a separação magnética as beads magnéticas são lavadas para remover os contaminantes e sais utilizando o tampão de lavagem A1 e tampão de lavagem A2 (etanol 80%). O etanol residual das lavagens prévias é removido por um passo de secagem. Finalmente, o DNA genômico purificado é eluído em tampão de eluição com pouco sal ou água. O DNA genômico purificado pode ser usado diretamente em outras aplicações. O Kit Biopur para extração de DNA genômico é utilizado de forma automatizada em conjunto com os Sistemas de Preparação de Amostras e Pipetagem Starlet e Nimbus. Devido ao alto grau de pureza, o DNA extraído está pronto para ser utilizado nos mais variados segmentos laboratoriais, inclusive em diagnóstico in vitro. As seguintes aplicações foram validadas para uso com esse kit: Aplicações em Biologia Molecular: Tipagem HLA; qpcr; PCR; Digestão por enzima de restrição; Análises RFLP; Análise SNP; Genotipagem. O produto é indicado para uso por profissionais treinados em técnicas de Biologia Molecular, em vários segmentos laboratoriais. Por não se tratar de material de uso específico em diagnóstico humano, quaisquer resultados gerados utilizando o procedimento de preparação de amostras em conjunto com qualquer análise de diagnóstico devem ser interpretados em conjunto com outras conclusões clínicas e laboratoriais. Para minimizar irregularidades nos resultados de diagnósticos, controles adequados devem ser empregados para dar suporte à avaliação diagnóstica. 2. CARACTERÍSTICAS DO PRODUTO O kit BIOPUR Mini Mag SLNB96 é destinado para rápida preparação manual ou automatizada de DNA genômico com alto grau de pureza a partir de 200µl de sangue total. O tempo para preparação manual para 96 amostras é de aproximadamente 120 minutos. O DNA obtido pode ser utilizado diretamente como template de PCR ou qualquer tipo de reação enzimática. 1

2 A quantidade de DNA purificado depende do tipo de amostra e do número de células na amostra (que varia conforme a idade do paciente e seu estado de saúde - e conforme condições de transporte, armazenamento e idade das amostras). Normalmente, uma amostra de 200µL de sangue total (contagem de células brancas intervalo de 3 x 10 6 a 1 x 10 7 células/ml) de um indivíduo sadio rende de 3 a 10µg de DNA. O kit BIOPUR Mini Mag SLNB96 fornece reagentes para purificação de 2-8µg de DNA genômico com alto grau de pureza de 200µl de sangue total com razão A 260 /A e concentração média de 20-40ng/µl. Dependendo do nível de saúde do doador de sangue e o volume de eluição utilizado, concentrações entre ng/µl podem ser obtidas. AMOSTRA INICIAL RENDIMENTO TEMPO RAZÃO 200µl de sangue total 2-8µg de DNA genômico 120 minutos (96 amostras) A 260 /A Sangue fresco ou congelado tratado com EDTA ou citrato podem ser utilizados. Este procedimento é otimizado para volume de 200µl de amostra. O kit BIOPUR Mini Mag SLNB96 pode ser processado completamente em temperatura ambiente, entretanto a eluição a 55 ou 72 C irá aumentar o rendimento em cerca de 15-20%. As beads são superparamagnéticas e altamente reativas. A capacidade de ligação é de aproximadamente 0,4µg de gdna para 1µl de suspensão de beads, sendo que este volume contém 140µg de beads. O rendimento e a qualidade do DNA genômico extraído é aplicável em qualquer sistema de detecção de diagnóstico molecular. Os testes de diagnóstico devem ser realizados de acordo com as especificações do fabricante. 3. COMPOSIÇÃO DO KIT INFORMAÇÕES PRINCIPAIS 1 x 96 Amostra 4 X 96 8x96 CÓDIGO DO PRODUTO BP BP BP Tampão de Lise A 1 x 9 ml 1 x 35 ml 2 x 35 ml Tampão de Ligação A 1 x 32 ml 1 x 130 ml 2 x 130 ml Tampão de Lavagem A1 1 x 165 ml 2 x 330 ml 4 x 330 ml Tampão de Lavagem A2* 1 x 17 ml 1 x 65 ml 2 x 65 ml Tampão de Eluição A 1 x 22mL 1 x 90 ml 2 x 90 ml Tampão de Proteinase 1 x 2,5mL 1 x 11 ml 2 x 11 ml Solução Beads 2 x 1,5 ml 8 x 1,5 ml 16 x 1,5 ml Proteinase K Tipo N* 1 x 50 mg 4 x 50 mg 8 x 50 mg 2

3 Placa de Coleta 2 ml 1 unid. 4 unid. 8 unid. Placa de Eluição 1,2 ml 1 unid. 4 unid. 8 unid. Filme Adesivo 2 unid. 8 unid. 16 unid. Instrução de Uso 1 unid. 1 unid. 1 unid. * Verificar item 8 - Reagentes e Equipamentos necessários, mas não fornecido e item 9 Preparo dos Reagentes 4. ARMAZENAMENTO DOS REAGENTES Todos os tampões e componentes do BIOPUR Kit Extração Mini MAG SL/NB96 devem ser armazenados em temperatura ambiente entre 15 e 30 C e, sob estas condições, são estáveis até a data de validade impressa na embalagem. Tampão de Lise A O Tampão de Lise A pode formar um precipitado de sal durante seu armazenamento. Para dissolver este precipitado deve-se incubar o frasco do tampão a 40 C até que todo precipitado se dissolva. Proteinase K A Proteinase K reconstituída deve ser armazenada a -20 C; recomenda-se dividir a solução em alíquotas para o armazenamento no freezer. Congelamentos e descongelamentos repetidos devem ser evitados. 5. INFORMAÇÃO DE SEGURANÇA Ver a seguir classificação de riscos e frases de segurança utilizadas internacionalmente, que se aplicam aos componentes do BIOPUR Kit Extração Mini Mag SLNB96: PRODUTOS RISCOS Tampão de Lise A R 22-36/37, S 26-37/39 Tampão de Ligação A R 10-22, S Tampão de Lavagem A R 10, S 16 Proteinase K R 36/37/38-42, S /37 LEGENDA DOS RISCOS R 10 Inflamável; R 22 Perigoso se inalado; R 36/37/38 Irritante aos olhos, sistema respiratório e contato com a pele; R 36/38 Irritante aos olhos e pele; R 42 Pode causar sensibilização por inalação; S 13 Manter longe de alimentos, bebidas e rações; S 16 Manter longe de fontes de ignição- Não fumar; 3

4 S 22 S 24 S 26 S 36/37 S 37/39 Não inalar o pó; Evitar contato com a pele; Em caso de contato com os olhos, lavar com água corrente e procurar um médico; Usar roupas e luvas protetoras; Usar óculos protetores; Para maiores informações leia a Ficha de segurança de Produto Químico. 6. AMOSTRAGEM E ARMAZENAMENTO, DE ACORDO COM O TIPO DE AMOSTRA BIOLÓGICA Sangue Total Os melhores resultados são obtidos empregando amostras frescas. Amostras de sangue total (conservadas com EDTA ou citrato) podem ser armazenadas a temperatura ambiente por 2 a 3 horas; para uma armazenagem rápida (até 24 horas) as amostras podem ser estocadas a 4 C. Para longo período de estocagem, é recomendado o congelamento das amostras a -20 C ou -80 C. Deve ser evitado congelamento e descongelamento seguidos antes da extração do DNA. 7. PROCEDIMENTO 7.1. Agitação Quando utilizar um agitador de placas para etapas de lavagem e eluição, o ajuste de velocidade deve ser feito cuidadosamente para cada tipo de placa e modelo de shaker para evitar a contaminação cruzada de poço para poço. Ajustando o agitador para etapas de lavagens e ligação: Adicionar 800µL de água com corante nos poços da placa de separação. Colocar a placa no agitador e iniciar a agitação em velocidade moderada por 30 segundos. Desligar o shaker e verificar se a superfície da placa ficou com gotículas de água corada. Aumentar a velocidade do agitador por mais 30 segundos e verificar a placa novamente. Continuar aumentando a velocidade até observar gotículas de corante na superfície da placa. Reduzir a velocidade e verificar a placa novamente, usar esta velocidade para a etapa de lavagem. Ajustando o agitador para a etapa de eluição: Adicionar 100µL de água corada nos poços da placa e proceder conforme os passos descritos acima Manuseio das Beads Distribuição das beads: Uma distribuição homogênea das beads magnéticas nos poços da placa de separação é essencial para resultados seguros. Portanto, antes de distribuir as beads, deve-se certificar de que elas estão completamente ressuspendidas. Agitar bem o frasco de armazenamento ou colocá-lo em um agitador. Realizar uma mistura prévia das beads com o tampão de ligação permite uma distribuição mais homogênea das beads. Durante a automação, uma etapa de pré-mistura antes de aspirar as beads/ mistura de beads e tampão de ligação é recomendada para manter as beads ressuspensas. 4

5 Tempo de separação magnética: A atração das beads magnéticas para os pinos magnéticos depende da força magnética dos pinos, da placa de separação selecionada, da distância da placa com os pinos e o volume a ser processado. Os tempos individuais para atração completa das beads para os pinos magnéticos devem ser verificados e ajustados em cada sistema. Recomenda-se usar as placas de separação ou tubos especificados pelo fornecedor do separador magnético. Lavando as Beads: A lavagem das beads pode ser realizada por agitação ou mistura. Em contraste com a mistura por pipetagem, (para cima e para baixo), a mistura no shaker ou agitador magnético permite uma mistura simultânea de todas as amostras. Isto reduz o tempo e o número de ponteiras necessárias para a preparação. A ressuspensão pipetando para cima e para baixo, no entanto, é mais eficiente do que a mistura por um agitador magnético ou shaker. Metodo Eficiencia de ressuspensão Velocidade Número de ponteiras Mistura magnética + ++ Baixo Shaker Baixo Pipetagem +++ +* Alto *Pipeta de 8 canais Eluição O DNA purificado pode ser eluído diretamente com o tampão de eluição fornecido. A eluição pode ser realizada em um volume 50 µl. É essencial cobrir as beads completamente com tampão de eluição durante o processo. O volume do tampão de eluição depende do sistema de separação magnética. Para a eluição eficiente, o sedimento de beads magnéticas deve ser completamente ressuspenso no tampão de eluição. Para alguns separadores, pode ser necessário volumes elevados para cobrir todo o sedimento. A eluição pode ser realizada em temperatura ambiente, porém o rendimento de DNA pode ser aumentado em 15-20% se for realizada a 72 C Isolamento do DNA genômico de sangue total Antes da preparação: Verificar se a Proteinase está preparada conforme sessão EQUIPAMENTOS E REAGENTES NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS Ponteiras condutivas descartáveis validadas pela Biometrix; Proveta (250 ml); Micropipeta monocanal e ponteiras com filtro; 5

6 Tubos primários; Vortex; Etanol P.A.; PBS 1X. 9. PREPARO DOS REAGENTES Antes de iniciar o protocolo preparar: Tampão de Lavagem A2: Adicionar o volume indicado de Etanol % ao Tampão de Lavagem A2 concentrado. Marcar no rótulo do frasco uma indicação de que o etanol foi adicionado. Proteinase K: Adicionar o volume indicado de Tampão de Proteinase para dissolver a Proteinase K liofilizada. REAGENTES 1 x 96 Amostra 4 X 96 8 X 96 Tampão de Lavagem A2 (Concentrado) Proteinase K 17 ml Adicionar 68 ml de Etanol % 65 ml Adicionar 260 ml de Etanol % 50 mg Adicionar 2,5mL de Tampão de Proteinase em cada frasco 10. PROTOCOLOS Antes de começar o ensaio: 1) Ligar o Sistema de Preparação de Amostras e Pipetagem Starlet ou Nimbus; 2) Colocar todos os reagentes em temperatura ambiente. Quando necessário, misturar delicadamente e dissolver novamente quaisquer precipitações, aquecendo a 30 C até a dissolução. Mexer gentilmente para evitar formação de espuma. 3) Selecionar o protocolo e iniciar o método; 4) Colocar as amostras, os materiais e reagentes necessários corretamente na plataforma do equipamento como mostrado no software, e iniciar o protocolo. IMPORTANTE: É recomendado fornecer pelo menos 500µL de amostra biológica por tubo de amostra, para prevenir erros de distribuição de pipetagem durante o processo. Não dispensar os volumes requeridos de reagentes nos tubos até o exato momento de começar um ensaio. Deixar os reagentes nos reservatórios por períodos prolongados resultará em evaporação (especialmente soluções com álcool) e formação de precipitações de sal, resultando em perda de condições de ligação. Por esta razão, reagentes preparados muito antes do ensaio devem ser descartados e um novo reservatório deve ser carregado na plataforma, com reagentes frescos. PROTOCOLO 1 Este protocolo é projetado para separadores magnéticos estáticos com pinos (por exemplo, NucleoMag SEP) e agitadores de placa adequados. Recomenda-se usar uma placa de poços quadrados de 6

7 separação (ver informações sobre pedidos). Este protocolo é para uso manual e serve como um guia para adaptar o kit à instrumentos robóticos. a. Lise da amostra Adicionar 20µL de proteinase e 200µL de amostra num tubo de reação ou placa. Adicionar 80 µl de Tampão de Lise A, misturar bem por pipetagem repetida para cima e para baixo e incubar a temperatura ambiente com agitação por 10 minutos. b. Ligação do DNA com as beads magnéticas Adicionar 25µL das Beads e 300µL de Tampão de Ligação A à amostra lisada. Misturar por pipetagem (para cima e para baixo) 6 vezes e agitar por 5 minutos a temperatura ambiente. As Beads e o Tampão de Ligação A podem ser pré misturados. Ressuspender as Beads antes de transferir do frasco de armazenamento. Misturar brevemente o frasco de armazenamento no vortex até que uma suspensão homogênea seja formada. Separar as Beads magnéticas ao lado dos poços, colocando a placa no magneto. Aguardar pelo menos 2 minutos até que todas as beads sejam atraídas para os ímãs. Remover e descartar o sobrenadante por pipetagem. Não mover as beads enquanto aspira o sobrenadante da placa. c. Lavagem de com Tampão de Lavagem A1 (primeira lavagem) Remover a placa do magneto. Adicionar 800µL de Tampão de Lavagem A1 e ressupender as beads por agitação até que os grânulos estejam completamente ressuspendidos (5 minutos). As beads podem ser ressuspendidas alternativamente por pipetagem. Separar as esferas magnéticas, colocando a placa no magneto e aguardar 2 minutos até que todas as beads sejam atraídas pelo imã. Retirar e eliminar o sobrenadante por pipetagem. d. Lavagem com Tampão de Lavagem A1 (segunda lavagem) Remover a placa do magneto. Adicionar 800µL de Tampão de Lavagem A1 e ressupender as beads por agitação até que os grânulos estejam completamente ressuspendidos (5 minutos). As beads podem ser ressuspendidas alternativamente por pipetagem. Separar as esferas magnéticas, colocando a placa no magneto e aguardar 2 minutos até que todas as beads sejam atraídas pelo imã. Retirar e eliminar o sobrenadante por pipetagem. e. Lavagem com Tampão de Lavagem A2 (etanol 80%) Remover a placa do magneto. Adicionaar 800µL de Tampão de Lavagem A2 e ressupender as beads por agitação até que os grânulos estejam completamente ressuspendidos (5 minutos). As beads podem ser ressuspendidas alternativamente por pipetagem. Separar as esferas magnéticas, colocando a placa no manegneto NucleoMag SEP e aguardar 2 minutos até que todas as beads sejam atraídas pelo imã. Retirar e eliminar o sobrenadante por pipetagem. Agitar por 10 minutos em temperatura ambiente para secar o etanol. f. Eluição 7

8 Adicionar o volume desejado de tampão de Eluição (50-100uL) a cada poço da placa e ressuspender as beads por agitação por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente. Alternativamente, ressuspender as beads por pipetagem e incubar a C por 10 minutos. Separar as esferas magnéticas, colocando a placa no magneto. Aguardar pelo menos 2 minutos até que todas as beads sejam atraídas pelos imãs. Transferir o sobrenadante contendo o DNA purificado para a placa de eluição. Lise da amostra 200µL de amostra 20 µl de Proteinase K 80 µl de Tampão de Lise A Misturar e incubar a TA por 10 min. Ligação do DNA com Beads magnéticas 300µL Tampão de Ligação F 25 µl beads. Misturar no shaker ou com a pipeta por 5 minutos a temperatura ambiente. Remova o sobrenadante após 2 minutos de separação. Lavagem com Tampão de Lavagem A1 (primeira lavagem) Remover a placa do Magneto Adicionar 800 µl Tampão de Lavagem A1. Ressuspender por 5 minutos a temperature ambiente. Remover o sobrenadante após 2 minutos. Laveagem com Tampão de Lavagem A1 (segunda lavagem) Remover a placa do Magneto Adicionar 800 µl Tampão de Lavagem A1. Ressuspender por 5 minutos a temperatura ambiente. 8

9 Remover o sobrenadante após 2 minutos. Lavagem com Tampão de Lavagem A2 (etanol 80%) Adicionar 800µL de Tampão de Lavagem A2. Ressuspender por 5 minutos a temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e agitar por 10 minutos para secar o etanol. Eluição DNA Remover a placa do Magneto. Adicionar µL Tampão de Eluição. Ressuspender por 5 minutos a temperatura ambiente ou a 55 C. Separarar por 2 minutos e transferir o DNA em placas/tubos de eluição. 11. CONTROLE DE QUALIDADE O fabricante e o distribuidor fornecem garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos seguintes termos: Garantia O produto BIOPUR Kit Mini Mag SLNB é garantido pela Mobius Life contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta. A garantia abrange defeitos de produção. Exceções na garantia: Tem garantia restrita: Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem inadequada. Extinção da garantia: Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação. 12. INFORMAÇÕES PARA PEDIDO PRODUTO TAMANHO DA EMBALAGEM CÓDIGO DO PRODUTO 9

10 BIOPUR Kit Extração Mini Mag SLNB x 96 testes BP BIOPUR Kit Extração Mini Mag SLNB x 96 testes BP INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Mobius Life Science Indústria e Comércio de Produtos para Laboratórios LTDA Rua Paraíso do Norte, CEP: Pinhais - PR CNPJ: / Responsável Técnica: Flávia Rosenstein Schiel - CRBio /07-D 14. DISTRIBUIDOR Biometrix Diagnóstica Ltda. Rua Estrada da Graciosa, 1081, Curitiba Paraná Brasil - CEP: Tel.: (41) Fax: (41) DDG: biometrix@biometrix.com.br Site: CNPJ: / Responsável Técnica: Flávia Stival CRF/PR: