Instruções de Uso XGEN MASTER EV Kit MASTER para Detecção de RNA de Enterovirus spp. (EV)

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1 Instruções de Uso XGEN MASTER EV Kit MASTER para Detecção de RNA de Enterovirus spp. (EV) 1. USO PRETENDIDO O Kit XGEN MASTER EV é destinado para a detecção qualitativa do DNA complementar (cdna) de Enterovírus spp. (EV), produto da reação de transcrição reversa, obtido a partir do RNA extraído de amostras de plasma e líquido cefalorraquidiano, com controle simultâneo de reação de amplificação através do Controle Interno (CI). O kit foi otimizado para uso nos aparelhos de PCR em Tempo Real ABI 7300 e ABI 7500 (Software Sequence Detection System Applied Biosystems ). PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO 2. INTRODUÇÃO O Enterovírus (EV), pertencente à família Picornaviridae, possui genoma de RNA de fita simples e é um patógeno com alta incidência em todo o mundo. O EV é responsável por afetar diversos órgãos do corpo, provocando uma variedade de manifestações clínicas, as quais vão desde doença febril indiferenciada até paralisias graves e permanentes, e algumas vezes fatais. A infecção por EV ocorre por via fecal-oral, e a replicação viral ocorre inicialmente nas células do trato digestivo. A maior parte das infecções por EV são assintomáticas, porém dentre as síndromes clínicas causadas pelo vírus destacam-se aquelas que afetam o sistema nervoso central, pulmões e coração. Os ensaios moleculares, tal como o ensaio de PCR em Tempo Real, demonstrou ser uma ferramenta útil para o diagnóstico de infecção primária por EV por causa da alta sensibilidade e especificidade. O kit foi desenvolvido para identificar o RNA genômico dos sorotipos: Poliovirus 1-3, Coxsackievirus A1-A22, A-24, Coxsackievirus B1-B6, Echovirus 1-9, 11-21, 24-27, 29-33, Enterovirus PRINCÍPIO DO TESTE Esse kit realiza a detecção pelo método de PCR em Tempo Real, através de sondas e primers específicos. O RNA do Enterovirus spp. é recuperado das amostras biológicas durante a etapa de extração, retrotranscrito em cdna e posteriormente amplificado. O produto da amplificação é detectado por meio de uma sonda específica marcada com corante fluorescente para uma única sequência genômica do EV. O Controle Interno funciona como controle da amplificação para cada amostra processada individualmente, para identificação da presença de possíveis inibidores. O Controle Positivo Alto (CPA) e o Controle Positivo Baixo (CPB) são fornecidos como controle das reações da PCR. O limite de detecção (LOD) é a menor quantidade de cópias do alvo que pode ser detectada pelo sistema de ensaio com uma probabilidade de 95%. O resultado do limite de detecção para o Kit XGEN MASTER EV é igual a 2,5 cópias/μl. Limite de detecção 2,5 cópias/µl

2 4. COMPONENTES O formato padrão do kit contém reagentes para 100 testes. COMPONENTES CONTEÚDO QUANTIDADE MM EV Solução de Master Mix 4 microtubos/0,4 ml PS EV Primers/ Sondas Liofilizado 4 microtubos(*) ÁGUA ULTRAPURA Água Grau Biologia Molecular 2 microtubos/1,5 ml CN Controle Negativo 1 microtubos/1,5 ml CPA EV CPB EV Controle Positivo Alto Liofilizado (10000 cópias/µl) Controle Positivo Baixo Liofilizado (50 cópias/µl) 4 microtubos(*) 4 microtubos(*) CI EV Controle Interno Liofilizado 4 microtubos(*) MICROPLACA Microplaca para Reação 3 unidades FILME ADESIVO Filme Adesivo Óptico 3 unidades GUIA RÁPIDO Instrução de Uso 1 unidade (*) Material liofilizado que deverá ser diluído com Água Ultrapura, conforme volume indicado na etiqueta do componente. 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O Kit XGEN Master EV deve ser armazenado na embalagem original em temperatura controlada entre +2 C e +8 C e são estáveis até a data de vencimento indicada no rótulo. Uma vez dissolvidos, o componente PS EV e o componente CI EV são estáveis durante 4 meses em temperatura controlada entre -25 C e -15 C. Uma vez dissolvidos, os componentes CPA EV e CPB EV são estáveis por 2 semanas em temperatura controlada entre -25 C e -15 C. Recomenda-se realizar somente um ciclo de congelamento/descongelamento após a ressuspensão dos reagentes. Caso sejam utilizados de forma intervalada, sugere-se que sejam realizadas alíquotas em tubos livres de RNase e DNase, de acordo com a necessidade. 6. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS Micropipetas Calibradas (0,5 µl < volume < µl); Microcentrífuga; Agitador Tipo vortex ou similar; Racks para Tubos; Ponteiras Estéreis com Filtro; Microtubos Livre de Nuclease; Luvas Descartáveis Sem Talco; Termociclador* para PCR em Tempo Real; Cabine de fluxo laminar. *ATENÇÃO: Uma calibração válida dos filtros (Pure Spectra Component File) e do background (Background Component File) deve ser feita rotineiramente. 7. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado. 2. O pessoal técnico deve ser treinado no uso dos termocicladores em Tempo Real, na manipulação de reagentes de biologia molecular e qualificados em protocolos de amplificação de PCR em Tempo Real. 3. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar equipamentos de proteção individual. O uso de objetos perfuro-cortantes deve ser evitado. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor. 4. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados contra tétano, difteria, hepatite B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com a Norma Regulamentadora 32.

3 5. O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar. 6. Evitar vibração na superfície da bancada onde o teste é realizado. 7. Após o recebimento, armazenar o kit entre 2 C e 8 C em refrigerador ou câmara fria com temperatura controlada. 8. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits. Recomenda-se que os componentes entre dois kits do mesmo lote também não sejam trocados. 9. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis pesadas ou grumos. Caso contrário, comunicar o supervisor do laboratório para iniciar os procedimentos necessários para reposição do kit. 10. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada pipetagem. 11. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada pipetagem. 12. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta externa. 13. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as amostras devem ser manuseadas em Nível de Biossegurança II, como recomendado pela legislação em vigor. 14. Armazenar e extrair as amostras separadamente de outros reagentes e utilizar sala dedicada para o manuseio. 15. Dissolver os reagentes liofilizados com o volume correto apresentado no rótulo, com Água Ultrapura fornecida no kit. 16. Os componentes MM EV e PS EV são sensíveis à luz. Proteger de forte exposição à luz. 17. O fluxo de trabalho no laboratório deve proceder de maneira unidirecional, começando na área de extração e passando para a amplificação e área de análises de dados. Não retornar as amostras, equipamentos e reagentes para a área onde as primeiras etapas foram realizadas. 18. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos componentes líquidos ou na transferência dos componentes para sistemas automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada. 19. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados, de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor. 20. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das amostras devem ser absorvidos por lenços de papel umedecidos com hipoclorito, e em seguida, com água. 21. Outros resíduos gerados devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados, de acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais. 8. AMOSTRAS: PREPARAÇÃO E RECOMENDAÇÕES O ensaio é para uso com ácido nucleico extraído de amostras de líquido cefalorraquidiano e plasma de origem humana. 1. A amostra de líquido cefalorraquidiano deve ser coletada assepticamente através de punção lombar, e deve estar límpida e não hemolisada. 2. O sangue deve ser colhido assepticamente por punção venosa, e o plasma deve ser preparado usando técnicas padrões de preparação de amostras para laboratórios de análises clínicas. 3. Nenhuma influência foi observada na preparação de amostras com citrato e EDTA. ATENÇÃO: A heparina afeta as reações de PCR.

4 Amostras que foram coletadas em tubos contendo heparina como anticoagulante não devem ser utilizadas. As amostras de pacientes heparinizados também não devem ser utilizadas. 4. Evitar qualquer adição de conservantes nas amostras. 5. As amostras devem ser identificadas claramente com códigos ou nomes na intenção de evitar erros de interpretação. 6. Amostras hemolizadas e hiperlipêmicas devem ser descartadas, pois podem gerar falsos resultados. 7. Amostras contendo resíduos de fibrinas, partículas pesadas ou filamentos e corpos microbianos devem ser descartadas, pois podem gerar falsos resultados. 8. As amostras de plasma para extração de RNA devem ser coletadas de acordo com os procedimentos laboratoriais comuns, transportados e armazenados entre 2 C a 8 C, por período máximo de 4 horas. 9. As amostras de plama podem ser armazenadas a -20 C por no máximo 30 dias ou a -70 C por longos períodos. 10. É recomendado, para melhor armazenamento das amostras, separá-las em várias alíquotas (volume mínimo de 300 µl) e armazená-las congeladas a -20 C por um período máximo de 30 dias ou -80 C por períodos maiores. Evitar ciclos repetidos de congelamento/ descongelamento. 11. Quando não utilizar imediatamente após a coleta, é recomendado armazenar as amostras de plasma e líquido cefalorraquidiano em temperatura estável de -80 C. 12. Quando utilizar amostras congeladas, só descongelar no momento da extração, a fim de evitar possíveis casos de degradação do ácido nucléico. Para utilização do kit com outras amostras deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 9. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS MM EV Solução pronta para uso. Antes de utilizar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. AVISO: A MM EV é sensível à luz. Proteger de forte exposição à luz. PS EV Centrifugar o frasco a rpm por 2 minutos. Abrir cuidadosamente a tampa do frasco evitando dispersão de pó. Ressuspender homogeneamente o componente liofilizado com o volume da Água Ultrapura indicado no rótulo do frasco. Homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). Aguardar 10 minutos em temperatura ambiente (15 C<TA<25 C). Homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. AVISO: Os Primers e Sondas XGEN são sensíveis à luz. Proteger de forte exposição à luz. ÁGUA ULTRAPURA Solução pronta para uso. CN Solução pronta para uso.

5 CPA EV (Controle Positivo Alto) Centrifugar o frasco a rpm por 2 minutos. Abrir cuidadosamente a tampa do frasco evitando dispersão de pó. Ressuspender homogeneamente o componente liofilizado com o volume da Água Ultrapura indicado no rótulo do frasco. Homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). Aguardar 10 minutos em temperatura ambiente (15 C<TA<25 C). Homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. CPB EV (Controle Positivo Baixo) Centrifugar o frasco a rpm por 2 minutos. Abrir cuidadosamente a tampa do frasco evitando dispersão de pó. Ressuspender homogeneamente o componente liofilizado com o volume da Água Ultrapura indicado no rótulo do frasco. Homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). Aguardar 10 minutos em temperatura ambiente (15 C<TA<25 C). Homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. CI EV Centrifugar o frasco a rpm por 2 minutos. Abrir cuidadosamente a tampa do frasco evitando dispersão de pó. Ressuspender homogeneamente o componente liofilizado com o volume da Água Ultrapura indicado no rótulo do frasco. Homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). Aguardar 10 minutos em temperatura ambiente (15 C<TA<25 C). Homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. 10. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O KIT Micropipetas Devem estar calibradas para distribuir o volume correto necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações das partes que podem acidentalmente entrar em contato com a amostra. Elas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de mostrar precisão de 1% e exatidão de ± 5%. Equipamento O Kit XGEN MASTER EV é direcionado para uso em combinação com os aparelhos de PCR em Tempo Real ABI 7300 e ABI Os usuários finais devem seguir estritamente a instrução de uso fornecida pelo fabricante. Para utilização do kit em outros equipamentos deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 11. CONTROLE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES 1. Verificar a data de validade do kit impresso na etiqueta externa da caixa. 2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por partículas visíveis a olho nu ou grumos. Verificar se no fundo dos frascos dos componentes liofilizados há um pellet bem formado. Verificar se há ruptura na caixa de transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa. 3. Ressuspender os componentes liofilizados com a quantidade adequada de Água Ultrapura. 4. Ligar o termociclador, verificar as configurações e certificar-se de utilizar o protocolo de ensaio correto. 5. Seguir estritamente o manual do equipamento fornecido pelo fabricante para a correta configuração do termociclador em Tempo Real.

6 6. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume necessário. 7. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso. 8. Em caso de problemas, não continuar o teste e comunicar ao responsável pelo laboratório. 12. PROTOCOLO IMPORTANTE: Um exemplo de gabarito para dispensação dos reagentes é informado no item 13. CONTROLES DE AMPLIFICAÇÃO É obrigatório validar cada sessão de amplificação com reações de Controle Negativo (CN), Controle Positivo Alto (CPA) e Controle Positivo Baixo (CPB). A pipetagem dos reagentes reconstituídos deve ocorrer imediatamente após a homogeneização em agitador tipo vortex e breve centrifugação (pulso). # Reações Componente PREPARAÇÃO DA MISTURA DE AMPLIFICAÇÃO CI como Controle de Amplificação x 1 x 25 x 50 x 100 MM EV 12,5 µl 312,5 µl 625 µl µl PS EV 2 µl 50 µl 100 µl 200 µl CI EV 1 µl 25 µl 50 µl 100 µl ÁGUA ULTRAPURA 4,5 µl 112,5 µl 225 µl 450 µl Volume Total 20 µl 500 µl µl µl Homogeneizar o reagente MM EV em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). Homogeneizar os reagentes PS EV e CI EV já reconstituídos em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). Pipetar a quantidade requerida dentro do microtubo, de acordo com a relação da quantidade dos outros reagentes. Trocar as ponteiras após cada passo de pipetagem. MONTAGEM DA REAÇÃO Dispensar 20 µl da mistura de amplificação em cada poço da microplaca conforme gabarito de teste. Adicionar 5 µl de cada AMOSTRA, CN, CPA e CPB conforme gabarito de teste. Selar a microplaca. Centrifugar brevemente a microplaca a rpm. Não deixar a microplaca preparada em temperatura ambiente por mais de 30 minutos e exposta à luz. Colocar a microplaca no termociclador de PCR em Tempo Real. Após configurar as operações descritas no subitem PROGRAMAÇÃO DO EQUIPAMENTO, iniciar a corrida no termociclador. NOTA IMPORTANTE: Após a ressuspensão dos componentes liofilizados, eles não são estáveis por mais de 3 horas, se mantidos entre 2 C a 8 C. Após a rotina, descartar adequadamente o material. Separar um microtubo de 1,5 ml para preparar a mistura de amplificação. Programação da PCR PROGRAMAÇÃO DO EQUIPAMENTO A programação deve ser feita conforme descrito abaixo.

7 Fase Temperatura Tempo # Ciclos Hold 50 C 2 min. 1 Hold 95 C 10 min. 1 Ciclo PCR 95 C 15 seg. (*Coleta de Dados) 60 C (*) 1 min. AVISO: Configurar o equipamento com a correta programação da PCR seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. 50 Seleção de Detectores Selecionar os detectores informados na tabela abaixo, conforme o manual de instrução do equipamento a ser utilizado. Detecção Repórter Quencher EV FAM Não Fluorescente CI JOE/VIC Não Fluorescente Configurar ROX como referência passiva. 13. GABARITO DE TESTE Exemplo de gabarito para posicionamento das amostras e reagentes para uma análise qualitativa. LEGENDA: CPA = Controle Positivo Alto (10 4 ) cópias/µl CPB = Controle Positivo Baixo 50 cópias/µl CN = Controle Negativo A1 A8 = Amostras FUNDO AMARELO: Mistura de Amplificação (MM EV + PS EV + ÁGUA ULTRAPURA) 14. CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO Configurações Pré-Análise Definir BASELINE, de acordo com as informações abaixo. ABI TM SDS 7300 ABI TM SDS 7500 BASELINE De 3 a 15 ciclos.

8 Amostra Desconhecida Configurar manualmente o THRESHOLD, de acordo com as informações abaixo. THRESHOLD FAM JOE/VIC ABI TM SDS ,15 0,02 ABI TM SDS ,15 0,02 Análises de Dados Uma verificação é realizada nos controles positivos sempre que o kit é utilizado a fim de verificar se os valores de Ct são os esperados e informados na tabela abaixo. ABI TM SDS 7300 e 7500 Verificar FAM Critério CPA EV 23 Ct < 27 CPB EV 31 Ct < 35 Para cada amostra o repórter fluorescente FAM e JOE/VIC são adotados para validar a detecção de RNA de EV como descrito na tabela abaixo. Ct FAM Ct JOE/VIC Resultado do Ensaio DETERMINADO INDETERMINADO DETERMINADO INDETERMINADO VÁLIDO VÁLIDO* < 42 VÁLIDO 42 ou INDETERMINADO INVÁLIDO** ** Nestes casos podem ocorrer problemas durante a etapa de amplificação (ineficiência ou ausência de amplificação) ou durante a etapa de extração (presença de inibidores ou amostras iniciais contendo número insuficiente de células), o qual pode levar a resultados incorretos e falsos negativos. O procedimento deve ser repetido iniciando a partir da etapa de extração usando amostra fresca vinda do paciente. 15. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS Os resultados obtidos com o Kit XGEN MASTER EV devem ser interpretados pelos responsáveis do laboratório levando em consideração os sintomas clínicos dos pacientes e outros parâmetros de laboratório relacionados às condições do paciente. FAM JOE/VIC Resultado Verificar + +/- RESULTADO CORRETO Positivo Importante: Alta concentração de RNA de EV pode levar a um Sinal Fluorescente REDUZIDO ou AUSENTE do Controle Interno devido à competição dos reagentes. * A alta concentração inicial de RNA de EV na amostra (SINAL DE FAM POSITIVO) pode levar a um sinal REDUZIDO ou AUSENTE do Controle Interno devido à competição entre os reagentes.

9 CPA / CPB CN Atenção: Possibilidade de inibição, erro no procedimento ou mau funcionamento do equipamento. RESULTADO CORRETO Negativo 1. Se os componentes foram preparados corretamente. 2. Se nenhum erro foi realizado no procedimento do ensaio. 3. Se as seleções dos corantes estão corretas, FAM para detecção do alvo e JOE/VIC para detecção do Controle Interno. 4. Se as análises foram realizadas com a configuração correta do equipamento. 5. Se o kit foi armazenado corretamente. 6. Se nenhum dos potenciais inibidores de PCR contaminaram os tubos. 7. Se o procedimento de extração foi executado corretamente. N/A - -/+ - + Atenção: Possibilidade de erro de pipetagem ou no procedimento. RESULTADO CORRETO 1. Se os componentes foram preparados corretamente. 2. Se nenhum erro foi realizado no procedimento do ensaio. 3. Se as seleções dos corantes estão corretas, FAM para detecção do alvo e JOE/VIC para detecção do Controle Interno. 4. Se as análises foram realizadas com a configuração correta do equipamento. 5. Se o kit foi armazenado corretamente. 6. Se nenhum dos potenciais inibidores de PCR contaminaram os tubos. N/A + +/- RESULTADO CORRETO Importante: Alta concentração de RNA de EV pode levar a um Sinal Fluorescente REDUZIDO ou AUSENTE do Controle Interno devido à competição dos reagentes.

10 + +/- Atenção: Possibilidade de contaminação. 1. Se os componentes foram preparados corretamente. 2. Se nenhum erro foi realizado no procedimento do ensaio. 3. Se a área de trabalho e os equipamentos são descontaminados regularmente. 4. Se o kit foi armazenado corretamente. NOTA IMPORTANTE: Interpretação dos resultados deve ser feita sob a supervisão do responsável do laboratório para reduzir o risco de erros e resultados mal interpretados. Quando os resultados do laboratório são transmitidos do laboratório para o centro de informática, deve-se prestar muita atenção para evitar erro na transferência de dados. Se um ou mais dos problemas descritos na tabela acima acontecer, depois da investigação, informe qualquer problema residual ao supervisor para futuras ações. de EV precisa e reprodutíveis. A determinação do RNA de EV em uma amostra do paciente tem implicações médicas, sociais, psicológicas e econômicas. É recomendado que a confidencialidade, aconselhamento apropriado e avaliação médica sejam considerados como aspectos essenciais na sequência dos testes. 17. GARANTIA DA QUALIDADE A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos seguintes termos: GARANTIA O produto XGEN MASTER EV é garantido pela Mobius contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta. A garantia abrange defeitos de produção. EXCEÇÕES NA GARANTIA: Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem inadequada. EXTINÇÃO DA GARANTIA: Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação. 16. LIMITAÇÕES Para o usuário deste kit recomenda-se a leitura cuidadosa e a compreensão da Instrução de Uso. A adesão estrita ao protocolo é necessária para a obtenção de resultados confiáveis. Em particular, a veracidade da amostra, a pipetagem de reagentes, a aplicação de fluxo de trabalho correto, juntamente com a etapa da programação cuidadosa do termociclador, é essencial para detecções de RNA 18. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Mobius Life Science Comércio de Produto para Laboratórios Ltda. Rua Paraíso do Norte, 866. CEP: Pinhais/PR BRASIL Fone: Fax: info@mobiuslife.com.br Website: CNPJ: /

11 19. REGISTRO ANVISA RESPONSÁVEL TÉCNICA Flávia Rosenstein Schiel CRBio /07-D