Instruções de Uso XGEN MASTER CT Kit Master para Detecção de DNA de Chlamydia trachomatis
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- Ana Lívia Thais Lagos Espírito Santo
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1 Instruções de Uso XGEN MASTER CT Kit Master para Detecção de DNA de Chlamydia trachomatis 1. USO PRETENDIDO O kit de PCR em Tempo Real para detecção do DNA de Chlamydia trachomatis (XG-CT-MB) é destinado para a detecção do DNA genômico de Chlamydia tracomatis (CT) em amostra humana de swab uretral/cervical e de urina, com controle simultâneo de reação de extração/amplificação através do Controle Interno (CI). O kit foi otimizado para uso nos aparelhos de PCR em Tempo Real ABI Sequence Detection System 7300 (Software SDS Version 1.4, Applied Biosystems *) e 7500 (Software SDS Version 1.3.1, Applied Biosystems *). *Applied Biosystems é uma marca registrada e ABI PRISM é uma marca registrada da Corporação Applera ou subsidiárias nos EUA e/ou outros países. PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: O kit está habilitado a detectar a variante sueca de Chlamydia trachomatis. 2. INTRODUÇÃO A Chlamydia trachomatis (CT), bactéria intracelular obrigatória, é a responsável pela infecção sexualmente transmissível mais comum no mundo. A infecção por CT pode causar uretrite, cervicite e doença inflamatória pélvica em mulheres. Mais de 50% das infecções por CT são assintomáticas e podem continuar desta forma por longos períodos. Em mulheres, as infecções pélvicas não tratadas ou não diagnosticadas podem atingir o trato genital superior, causando doença inflamatória pélvica e gravidez ectópica. A infertilidade em homens e mulheres pode ser resultado de infecções por CT não tratadas ou sem diagnóstico. A CT possui um único cromossomo com pares de base. O genoma codifica aproximadamente 875 proteínas, mas nem todas são necessariamente expressas. Além do cromossomo, a CT geralmente possui um elemento genético extracromossomal (plasmídeo críptico) de pares de base, extremamente conservado, com menos de 1% na variação da sequência nucleotídica. Devido à alta sensibilidade, técnicas de amplificação de ácidos nucleicos têm substituído as técnicas de cultura celular e de detecção de anticorpos no diagnóstico de infecções por CT. 3. PRINCÍPIO DO TESTE Esse kit realiza a detecção pelo método de PCR em Tempo Real, através de sondas e iniciadores específicos. O DNA de Chlamydia trachomatis, é recuperado das amostras biológicas durante a etapa de extração, e posteriormente amplificado. O produto da amplificação é detectado por meio de uma sonda específica marcada com corante fluorescente para as sequências genômicas altamente repetitivas (1 a 10 vezes) de CT. O Controle Interno heterólogo funciona como controle interno da extração/amplificação para cada amostra processada individualmente, para identificação da presença de possíveis inibidores. O Controle Positivo Alto (CPA) e o Controle Positivo Baixo (CPB) são fornecidos como controle das reações da PCR. O limite de detecção (LOD) é a menor quantidade de cópias do alvo que pode ser detectada pelo sistema de ensaio com uma probabilidade de 95%. O resultado do limite de detecção para o Kit XGEN MASTER CT é igual a 0,53 cópias/μl.
2 4. COMPONENTES O formato padrão do kit contém reagentes para 100 testes. COMPONENTES CONTEÚDO QUANTIDADE MM CT Solução de Master Mix 4 microtubos/0,4 ml PS CT Primers/ Sondas Liofilizado 4 microtubos(*) Água Ultrapura Água Grau Biologia Molecular 4 microtubos/1,5 ml CN Controle Negativo 1 microtubos/1,5 ml CPA CT CPB CT Controle Positivo Alto Liofilizado (10 4 cópias/µl) Controle Positivo Baixo Liofilizado (10 cópias/µl) 4 microtubos(*) 4 microtubos(*) CI CT Controle Interno Liofilizado 4 microtubos(*) Microplaca Microplaca para Reação 3 unidades Filme Adesivo Filme Adesivo Óptico 3 unidades Guia Rápido Instrução de Uso 1 unidade (*) Material liofilizado que deverá ser diluído com Água Ultrapura, conforme volume indicado na etiqueta do componente. 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O Kit XGEN MASTER CT deve ser armazenado entre 2 C e 8 C. Uma vez dissolvidos, os PS CT e o CI CT são estáveis por 4 meses a -20 C. Uma vez dissolvido, o CPA CT e CPB CT são estáveis por 2 semanas a -20 C. Após a ressuspensão do produto somente um ciclo de congelamento/ descongelamento é recomendado, dessa forma, sugere-se que sejam realizadas alíquotas em tubos livres de RNAse e DNAse. 6. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS Micropipetas Calibradas (0,5 µl < volume < µl); Microcentrífuga; Agitador Tipo Vórtex ou similar; Racks para Tubos; Ponteiras Estéreis com Filtro; Microtubos Livre de Nuclease; Microtubos de 0,2 ml ou Microplacas de PCR, recomendados pelo fabricante dos equipamentos de PCR em Tempo Real; Luvas Descartáveis Sem Talco; Termociclador* para PCR em Tempo Real. ATENÇÃO: Uma calibração válida dos filtros (Pure Spectra Component File) e do background (Background Component File) deve ser feita rotineiramente. 7. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado. 2. O pessoal técnico deve ser treinado no uso dos termocicladores em Tempo Real, na manipulação de reagentes de biologia molecular e qualificados em protocolos de amplificação de PCR em Tempo Real. 3. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar equipamentos de proteção individual. O uso de objetos perfurocortantes deve ser evitado. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor. 4. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados contra tétano, difteria, hepatite B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com a Norma Regulamentadora O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar.
3 6. Evitar vibração na superfície da bancada onde o teste é realizado. 7. Após o recebimento, armazenar o kit entre 2 C e 8 C em refrigerador ou câmara fria com temperatura controlada. 8. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits. Recomenda-se que os componentes entre dois kits do mesmo lote também não sejam trocados. 9. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis pesadas ou grumos. Caso contrário, comunicar o supervisor do laboratório para iniciar os procedimentos necessários para reposição do kit. 10. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada pipetagem. 11. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada pipetagem. 12. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta externa. 13. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as amostras devem ser manuseadas em Nível de Biossegurança II, como recomendado pela legislação em vigor. 14. Armazenar e extrair as amostras separadamente de outros reagentes e utilizar sala dedicada para o manuseio. 15. Dissolver os reagentes liofilizados com o volume correto apresentado no rótulo, com Água Ultrapura fornecida no kit. 16. Os componentes Master Mix XGEN e Primers e Sondas XGEN são sensíveis à luz. Proteger de forte exposição à luz. 17. O fluxo de trabalho no laboratório deve proceder de maneira unidirecional, começando na área de extração e passando para a amplificação e área de análises de dados. Não retornar as amostras, equipamentos e reagentes para a área onde as primeiras etapas foram realizadas. 18. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos componentes líquidos ou na transferência dos componentes para sistemas automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada. 19. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados, de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor. 20. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das amostras devem ser absorvidos por lenços de papel umedecidos com hipoclorito, e em seguida, com água. 21. Outros resíduos gerados devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados, de acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais. 8. AMOSTRAS: PREPARAÇÃO E RECOMENDAÇÕES 1. Swabs cervicais e uretrais devem ser coletados em meio de transportes com conservantes para ácidos nucleicos de bactérias. 2. Para amostras de urina, devem-se utilizar os primeiros 20 a 30 ml do fluxo de urina, que é a fração que contém maior concentração de componentes relevantes para diagnóstico. 3. Usar para urina tubos de polipropileno sem adição de conservantes. 4. Swabs uretrais e cervicais e amostras de urina devem ser pré-tratados antes da extração de DNA. 5. Urina e amostras de swabs devem ser transportados e estocados de 2 C a 8 C por um período máximo de 3 dias. É recomendado, para melhor armazenamento, aliquotar as amostras em volumes máximos de 100 µl e estocar entre -20 C a -80 C por um período máximo de 30 dias, evitando repetidos ciclos de congelamento e descongelamento.
4 6. Quando utilizar amostras congeladas, descongelar no momento da extração, evitando assim, a degradação de ácidos nucleicos. 7. As amostras devem ser identificadas claramente com códigos ou nomes na intenção de evitar erros de interpretações. OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: Para utilização do kit com outras amostras deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 9. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS Para a extração, 5 µl de Controle Interno poderá ser adicionado ao tampão de lise, anterior à adição da amostra, de acordo com a Instrução de Uso fornecida pelo fabricante do kit de extração. componente liofilizado com o volume da Água Ultrapura indicado no rótulo do frasco. Homogeneizar em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso). Aguardar 10 minutos em temperatura ambiente (15 C<RT<25 C). Homogeneizar em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. Aviso: Os Primers e Sondas XGEN são sensíveis à luz. Proteger de forte exposição à luz. Água Ultrapura Solução pronta para uso. Controle Negativo - CN Solução pronta para uso. OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: O Controle Interno (CI) que acompanha o kit de detecção pode ser usado no procedimento de extração como controle de extração. O valor de Ct do CI é usado para avaliar se o procedimento de extração foi realizado corretamente. Master Mix - MM CT Solução pronta para uso. Antes de utilizar, homogeneizar em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. AVISO: A Master Mix XGEN é sensível à luz. Proteger de forte exposição à luz. Primers e Sonda - PS CT Centrifugar o frasco a rpm por 2 minutos. Abrir cuidadosamente a tampa do frasco evitando dispersão de pó. Ressuspender homogeneamente o Controle Positivo Alto - CPA CT Centrifugar o frasco a rpm por 2 minutos. Abrir cuidadosamente a tampa do frasco evitando dispersão de pó. Ressuspender homogeneamente o componente liofilizado com o volume da Água Ultrapura indicado no rótulo do frasco. Homogeneizar em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso). Aguardar 10 minutos em temperatura ambiente (15 C<RT<25 C). Homogeneizar em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. Controle Positivo Baixo - CPB CT Centrifugar o frasco a rpm por 2 minutos. Abrir cuidadosamente a tampa do frasco evitando dispersão de pó. Ressuspender homogeneamente o componente liofilizado com o volume da Água Ultrapura indicado no rótulo do frasco. Aguardar 10 minutos em temperatura ambiente (15 C<RT<25 C).
5 Homogeneizar em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. Controle Interno - CI CT Centrifugar o frasco a rpm por 2 minutos. Abrir cuidadosamente a tampa do frasco evitando dispersão de pó. Ressuspender homogeneamente o componente liofilizado com o volume da Água Ultrapura indicado no rótulo do frasco. Homogeneizar em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso). Aguardar 10 minutos em temperatura ambiente (15 C<RT<25 C). Homogeneizar em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. 10. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O KIT Micropipetas Devem ser calibradas para distribuir o volume correto necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações das partes que podem acidentalmente entrar em contato com a amostra. Elas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de mostrar precisão de 1% e exatidão de +/- 5%. Equipamento O Kit XGEN Master CT é direcionado para uso em combinação somente com os Termocicladores ABI Sequence Detection System 7300 (Software Versão 1.4, Applied Biosystems ) e 7500 (Software SDS Versão 1.3.1, Applied Biosystems ). Os usuários finais devem seguir estritamente a instrução de uso fornecida pelo fabricante. Para utilização do kit em outros equipamentos deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 11. CONTROLE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES 1. Verificar a data de validade do kit impresso na etiqueta externa da caixa. 2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por partículas visíveis a olho nu ou grumos. Verificar se no fundo dos frascos dos componentes liofilizados há um pellet bem formado. Verificar se há ruptura na caixa de transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa. 3. Ressuspender os componentes liofilizados com a quantidade adequada de Água Ultrapura como descrito no item Ligar o termociclador, verificar as configurações e certificar-se de utilizar o protocolo de ensaio correto. 5. Seguir estritamente o manual do equipamento fornecido pelo fabricante para a correta configuração do termociclador em Tempo Real. 6. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume necessário. 7. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso. 8. Em caso de problemas, não continuar o teste e comunicar ao responsável pelo laboratório. 12. PROTOCOLO
6 IMPORTANTE: Um exemplo de gabarito para dispensação dos reagentes é informado no item Gabarito do Teste. Favor, consultar o item antes de começar a ler as instruções abaixo. NOTA IMPORTANTE: Utilizar somente microtubos ópticos ou microplacas recomendados pelos fabricantes de termocicladores em Tempo Real. NOTA IMPORTANTE: Se o Controle Interno foi adicionado no procedimento de extração do DNA, preparar a Mistura de Amplificação para amostras como na tabela abaixo. MONTAGEM DA REAÇÃO Preparar os componentes como descrito no item 9. Separar a quantidade necessária de microtubos ou a microplaca para a reação. Considerar que as amostras, devem ser testadas em duplicatas, se possível. Incluir pelo menos um poço para Controle Negativo (CN). Preparar a mistura de amplificação para as AMOSTRAS, CN e CPA e CPB, como na tabela abaixo. # Reações Componente CI como Controle de Extração/Amplificação x 1 x 25 x 50 x 100 Master Mix 12,5 µl 312,5 µl 625 µl µl Primers e Sondas 2 µl 50 µl 100 µl 200 µl Água Ultrapura 0,5 µl 12,5 µl 25 µl 50 µl Volume Total 15 µl 150 µl 750 µl µl PROCEDIMENTO DE AMPLIFICAÇÃO Dispensar 15 µl da mistura em cada microtubo ou poço da microplaca. ATENÇÃO: A pipetagem dos reagentes reconstituídos deve ocorrer imediatamente após a homogeneização em agitador tipo vórtex e breve centrifugação (pulso). Adicionar 10 µl de AMOSTRAS, CN, CPA e CPB em cada microtubo ou poço da microplaca. Fechar os microtubos ou selar a microplaca. PREPARAÇÃO DA MISTURA DE AMPLIFICAÇÃO CI como Controle de Amplificação Centrifugar brevemente os microtubos ou microplaca a x g. Não deixar os microtubos ou a microplaca preparada em temperatura ambiente por mais de 30 minutos e exposta à luz. # Reações Componente x 1 x 25 x 50 x 100 Master Mix 12,5 µl 312,5 µl 625 µl µl Primers e Sondas 2 µl 50 µl 100 µl 200 µl Controle Interno 0,5 µl 12,5 µl 25 µl 50 µl Volume Total 15 µl 150 µl 750 µl µl Colocar os microtubos ou a microplaca no termociclador de PCR em Tempo Real. Após configurar as operações descritas no subitem PROGRAMAÇÃO DO EQUIPAMENTO, iniciar a corrida no termociclador.
7 NOTA IMPORTANTE: Após a ressuspensão dos componentes liofilizados, eles não são estáveis por mais de 3 horas, se mantidos entre 2 C a 8 C. Após a rotina, descartar adequadamente o material. 13. GABARITO DE TESTE Exemplo de gabarito para posicionamento das amostras e reagentes para uma análise qualitativa. PROGRAMAÇÃO DO EQUIPAMENTO Programação da PCR A programação deve ser feita conforme descrito abaixo. Fase Temperatura Tempo # Ciclos Hold 50 C 2 min. 1 Hold 95 C 10 min. 1 Ciclo PCR 95 C 15 seg. (*Coleta de Dados) 60 C (*) 1 min. 45 A B C D E F G H CPA CPB CN A1 A1 A2 A2 LEGENDA: CPA = Controle Positivo Alto; CPB = Controle Positivo Baixo; CN = Controle Negativo; A1 e A2 = Amostras. AVISO: Configurar o equipamento com a correta programação da PCR seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Seleção de Detectores Selecionar os detectores informados na tabela abaixo, conforme o manual de instrução do equipamento a ser utilizado. 14. CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO Configurações Pré-Análise Definir BASELINE, de acordo com as informações abaixo. BASELINE ABI TM PRISM 7300 SDS BASELINE Automático ABI TM PRISM 7500 SDS Detecção Reporter Quencher Chlamydia trachomatis (CT) FAM Não Fluorescente Controle Interno (CI) JOE/VIC Não Fluorescente Referência Passiva ROX Não Presente Configurar manualmente o THRESHOLD, de acordo com as informações abaixo. THRESHOLD - FAM ABI TM PRISM 7300 SDS 0,12 ABI TM PRISM 7500 SDS 0,13
8 Amostra Desconhecida THRESHOLD - JOE/VIC ABI TM PRISM 7300 SDS 0,10 ABI TM PRISM 7500 SDS 0,08 (presença de inibidores ou amostras iniciais contendo número insuficiente de células), o qual pode levar a resultados incorretos e falsos negativos. O procedimento deve ser repetido iniciando a partir da etapa de extração usando amostra fresca vinda do paciente. Análises de Dados Uma verificação é realizada nos controles positivos sempre que o kit é utilizado a fim de verificar se os valores de Ct são os esperados e informados na tabela abaixo. ABI TM PRISM 7300 e 7500 SDS Verificar FAM Critério CPA CT 22 Ct < 26 CPB CT 31 Ct < 35 Para cada amostra o repórter fluorescente FAM e JOE/VIC são adotados para validar a detecção de DNA de CT como descrito na tabela abaixo. Ct FAM Ct JOE/VIC Resultado do Ensaio DETERMINADO INDETERMINADO DETERMINADO INDETERMINADO VÁLIDO VÁLIDO* < 40 VÁLIDO > 40 ou INDETERMINADO INVÁLIDO** 15. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS Os resultados obtidos com o Kit XGEN MASTER CT devem ser interpretados pelos responsáveis do laboratório levando em consideração os sintomas clínicos dos pacientes e outros parâmetros de laboratório relacionados às condições do paciente. FAM JOE/VIC Resultado Verificar + +/- RESULTADO CORRETO Positivo Importante: Alta concentração de DNA de CT pode levar a um Sinal Fluorescente REDUZIDO ou AUSENTE do Controle Interno devido à competição dos reagentes. * A alta concentração inicial de DNA de CT (SINAL DE FAM POSITIVO) pode levar a um sinal REDUZIDO ou AUSENTE do Controle Interno devido à competição entre os reagentes. ** Nestes casos podem ocorrer problemas durante a etapa de amplificação (ineficiência ou ausência de amplificação) ou durante a etapa de extração
9 CPA / CPB CN Atenção: Possibilidade de inibição, erro no procedimento ou mau funcionamento do equipamento. RESULTADO CORRETO Negativo 1. Se os componentes foram preparados corretamente. 2. Se nenhum erro foi realizado no procedimento do ensaio. 3. Se as seleções dos corantes estão corretas, FAM para detecção do alvo e JOE/VIC para detecção do Controle Interno. 4. Se as análises foram realizadas com a configuração correta do equipamento. 5. Se o kit foi armazenado corretamente. 6. Se nenhum dos potenciais inibidores de PCR contaminaram os tubos. 7. Se o procedimento de extração foi executado corretamente. N/A - -/+ - + Atenção: Possibilidade de erro de pipetagem ou no procedimento. RESULTADO CORRETO 1. Se os componentes foram preparados corretamente. 2. Se nenhum erro foi realizado no procedimento do ensaio. 3. Se as seleções dos corantes estão corretas, FAM para detecção do alvo e JOE/VIC para detecção do Controle Interno. 4. Se as análises foram realizadas com a configuração correta do equipamento. 5. Se o kit foi armazenado corretamente. 6. Se nenhum dos potenciais inibidores de PCR contaminaram os tubos. N/A + +/- RESULTADO CORRETO Importante: Alta concentração de DNA de CT pode levar a um Sinal Fluorescente REDUZIDO ou AUSENTE do Controle Interno devido à competição dos reagentes.
10 + +/- Atenção: Possibilidade de contaminação. 1. Se os componentes foram preparados corretamente. 2. Se nenhum erro foi realizado no procedimento do ensaio. 3. Se a área de trabalho e os equipamentos são descontaminados regularmente. 4. Se o kit foi armazenado corretamente. de CT precisa e reprodutíveis. A determinação do DNA de CT em uma amostra do paciente tem implicações médicas, sociais, psicológicas e econômicas. É recomendado que a confidencialidade, aconselhamento apropriado e avaliação médica sejam considerados como aspectos essenciais na sequência dos testes. 17. GARANTIA DA QUALIDADE A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos seguintes termos: Garantia NOTA IMPORTANTE: Interpretação dos resultados deve ser feita sob a supervisão do responsável do laboratório para reduzir o risco de erros e resultados mal interpretados. Quando os resultados do laboratório são transmitidos do laboratório para o centro de informática, deve-se prestar muita atenção para evitar erro na transferência de dados. Se um ou mais dos problemas descritos na tabela acima acontecer, depois da investigação, informe qualquer problema residual ao supervisor para futuras ações. 16. LIMITAÇÕES Para o usuário deste kit recomenda-se a leitura cuidadosa e a compreensão da Instrução de Uso. A adesão estrita ao protocolo é necessária para a obtenção de resultados confiáveis. Em particular, a veracidade da amostra, a pipetagem de reagentes, a aplicação de fluxo de trabalho correto, juntamente com a etapa da programação cuidadosa do termociclador, é essencial para detecções de DNA O produto XGEN MASTER CT é garantido pela Mobius contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta. A garantia abrange defeitos de produção. Exceções na garantia: Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem inadequada. Extinção da garantia: Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação. 18. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Mobius Life Science Comércio de Produto para Laboratórios Ltda. Rua Paraíso do Norte, 866. CEP: Pinhais/PR BRASIL Fone: Fax: info@mobiuslife.com.br Website:
11 CNPJ: / REGISTRO ANVISA RESPONSÁVEL TÉCNICA Flávia Rosenstein Schiel CRBio /07-D
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