Declaração de Conflito de Interesse. Adriana da Silva Santos Duarte Sem conflitos de interesse a declarar

Transcrição

1 Declaração de Conflito de Interesse Adriana da Silva Santos Duarte Sem conflitos de interesse a declarar

2 Banco de DNA, RNA e Células Como Arquivar Adriana da Silva Santos Duarte Bióloga- Hemocentro/Unicamp Doutora em Fisiopatologia Médica FCM/Unicamp

3 Biorrepositório (RESOLUÇÃO CNS Nº ) Início em 2011 Necessidade de atender a vários projetos de pesquisa Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) e CONEP Pacientes atendidos no Ambulatório e Enfermarias Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) Amostras de Medula e Sangue Periférico

4 Solicitação das Amostras Médico da equipe ou pesquisador responsável Sistema de Hematologia Requisição com dados do paciente Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) Equipe de enfermagem Biólogo

5 Recepção das amostras Biólogo ou pesquisador responsável Adequação da amostra, requisição, TCLE Numeração Referente ao Registro do Biorrepositório. Distribuição das amostras para processamento

6 Registro das Amostras Sigla RBC (Registro de identificação do Biorrepositório de um Conjunto de pesquisadores) Número sequencial EX: RBC 1307, RBC 2011 (requisição) Caderno de Registro do Biorrepositório Planilha RBC (planilha Excell) Médicos, Pesquisadores e Biólogos

7 Planilha RBC Identificação RBC, Nome, HC, Data coleta Tipo de amostra (SP ou MO), Hipótese Diagnóstica TCLE Diagnóstico Revisado pelo médico/pesquisador Nome do médico Tipos de amostras biológicas e destino Responsável pelo processamento

8 Amostras Biológicas (MO e/ou SP) Plasma Mononucleares Ficoll Granulócitos Eritrócitos Soro Gel Coagulo Plasma

9 Amostras Biológicas (MO e/ou SP) DNA (total) Plasma RNA (total) 4ml 4ml 4ml 4ml Células Mononucleares Soro 9ml x 4 9ml

10 Amostras Biológicas (MO e/ou SP) Tempo máximo para processamento Soro Plasma RNA Até 2 horas (T.A) Até 6 horas (T.A.) Células Momonucleares Até 24 horas (4 a 8 C) DNA Até 24 horas (T.A.) Até 10 dias (4 a 8 C)

11 Aliquotas de 0,5 ml Obtenção do Plasma Método de Centrifugação 3000 rpm 15 min T.A. plasma

12 Obtenção do Soro Método de Centrifugação 3000 rpm 10 min T.A. Soro Repouso 30 a 60 min T.A. Retração do Coagulo Aliquotas de 0,5 ml

13 Arquivamento do Plasma e Soro A B C D E Freezer vertical -20 C com degelo manual Freezer vertical -80 C com degelo manual

14 Extração de DNA Lise de hemácias por método químico (tampão detergente) Lise das membranas lipidicas dos leucócitos (tampão detergente) Purificação do DNA (solventes orgânicos/altas concentrações de sais) Precipitação do DNA (etanol absoluto) Reidratação do DNA (água)

15 Extração de DNA Metodos de Salting Out e Fenol-Clorofórmio (Adaptação) Lise Hemácias Residuais TKM1 + Triton Botão de leucócitos TKM1 Centrifugação rpm 5 min em microcentrífuga Estocar a -20 C Botão de leucócitos Centrifugação 2200 rpm por 15 min TKM2 SDS 10% Acetato de sódio Etanol Absoluto Gelado Centrifugação 12000rpm por 5min DNA Etanol 70% Gelado Centrifugação rpm por 5 min Secar T.A Água ou TE Geladeira 12 hs Banho maria 45 min a 37 C rpm 5 min microcentrífuga NaCl 5M 15 min T.A. Lise de hemácias Agitação vigorosa 15 min a 4 C Centrifugação 1800 rpm por 10 min Cloroformio/Alcool isoamílico Vortex Centrifugação rpm por 5 min Fenol/Cloroformio/Alcool Vortex Centrifugação rpm por 5 min Sobrenadante

16 Qualidade do DNA Eletroforese em gel de agarose 1% Cuba de Eletroforese e Fonte Transluminador (luz UV) RBC 14 RBC 275 RBC 476 RBC 13 RBC 07 Marcador

17 Arquivamento do DNA A B C D E Freezer vertical -20 C com degelo manual

18 Extração RNA Todos os reagentes e materiais são tratados para serem livres de RNAse (DEPc) Lise de hemácias por tampão alcalino Lise das membranas lipidicas dos leucócitos (trizol) Purificação do RNA (solventes orgânicos) Precipitação do RNA (etanol 75%) Reidratação do RNA (água)

19 Extração de RNA (Trizol) Centrifugação 12000xg 15 min a 4 C Fase aquosa (RNA) Cloroformio Inversão 5 min a T. A. Fase Orgânica Trizol Homogeneização 5 min a T. A. Fase Aquosa + Isopropanol 10 min a T. A. Centrigução 10 min 12000xg Secar a T. A. 4 C Eluir com água com DEPc Lise de hemácias Agitação vigorosa 15 min a 4 C Centrifugação 1800 rpm por 10 min RNA Alcool 75% Centrigução 7500 xg 5 min a 4 C

20 Qualidade do RNA Cuba de eletroforese RBC19 RBC113 RBC27 RBC73 RBC140 RBC56 28S 18S Transluminador (luz UV) Gel de agarose desnaturante 1,2% com formaldeído

21 Quantificação de DNA e RNA Espectrofotometria (nanodrop) DNA/RNA = 260nm Proteinas = 280nm 260nm quantificação 260nm/280nm indica pureza 260nm/280nm DNA 1,8 1,9 RNA 1,9 2,0 Compostos aromáticos Proteinas

22 Amplificação de Transcriptoma de RNAs raros RNA purificado (10ng/5µl) Transcrição reversa Mix RT (enzima de transcrição) e spin 30 min a 37 C 5 min a 95 C Kit de Amplificação Ligação Mix de ligação e spin 2h a 22 C Amplificação do Transcriptoma Mix de amplificação e spin 2 a 8hs a 30 C 5 min a 95 C Termociclador cdna amplificado

23 Arquivamento do RNA A B C D E Freezer vertical -80 C com degelo manual

24 Isolamento das Células Mononucleares Células mononucleares + PBS Células mononucleares são lavadas 2x a 1500 rpm por 10 min Plasma + PBS Células mononucleares Ficoll-Hypaque Granulócitos Hemácias Centrifugação a 1500 rpm 30 min a T. A. Tubos Criogênicos Botão de Células mononucleares Sangue total diluido Solução de Criopreservação Ficoll Camara de Neubauer

25 Criopreservação das Células Mononucleares Câmara de congelamento programável Durante o processo de congelamento é injetado Nitrogênio Líquido na câmara, obedecendo a programação estabelecida de temperaturas

26 Criopreservação das Células Mononucleares Sistema Mr. Frosty que permite o decaimento da temperatura 1 C por minuto (container com álcool isopropilico) Freezer vertical -80 C com degelo manual

27 Arquivamento das Células Mononucleares Tanque com Nitrogênio Liquido (- 196 C) A B C D E

28 Utilização das Amostras Os pesquisadores do projeto de pesquisa vinculado à amostra (pesquisadores envolvidos no projeto de pesquisa para o qual o TCLE foi assinado) terão acesso às amostras armazenadas.

29 Solicitação e Liberação das Amostras A liberação da amostra ocorrerá mediante solicitação por escrito do pesquisador, através do formulário de liberação de amostras

30 Liberação das Amostras e Controle As liberações serão registradas na planilha RBC, em colunas identificadas como fornecimento de alíquotas, onde deve constar o nome do pesquisador que recebeu a amostra. Os itens fornecidos (DNA, RNA, Plasma, Soro e Células monocucleares), seu volume e concentração, no caso de amostras de DNA e RNA, devem ser registrados na planilha RBC.

31 Agradecimentos