ROTEIRO INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA OBJETIVOS Geral Específicos METAS METODOLOGIA CRONOGRAMA ORÇAMENTO RELEVÂNCIA E IMPACTO NO DESENVOLVIMENTO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO DEPARTAMENTO DE AGRONOMIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA MELHORAMENTO GENÉTICO DE PLANTAS PPGAMGP SEMINÁRIO II O EU-ESTRESSE ESTRESSE NA MICROPROPAGAÇÃO DA CANA- DE-AÇÚCAR: VARIÁVEIS BIOQUÍMICAS E MOLECULARES Mestranda: Gemima Manço de Melo Orientadora: Profª. Dra. Lilia Willadino Co-orientador: orientador: Profº. Dr. Reginaldo de Carvalho

2 ROTEIRO INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA OBJETIVOS Geral Específicos METAS METODOLOGIA CRONOGRAMA ORÇAMENTO RELEVÂNCIA E IMPACTO NO DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO, TECNOLÓGICO E SÓCIO-ECONÔMICO APOIO FINANCEIRO

3 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA A cana-de de-açúcar Setor sucroalcooleiro brasileiro Competitivo mundialmente Níveis de produtividade e rendimento industrial Custos de produção

4 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA A cana-de de-açúcar Possui cadeia produtiva estruturada Domina estágios da tecnologia de produção Gera várias oportunidades de negócios

5 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA A cana-de de-açúcar Produção nordestina 2008/ milhões de toneladas Produção Nacional Nordeste 12% Brasil 88% (CONAB, 2009)

6 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA A cana-de de-açúcar Produção pernambucana 2008/ milhões de toneladas Álcool 33% Produção pernambucana Açúcar 67% (CONAB, 2009)

7 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA A cana-de de-açúcar Uso de tecnologias matérias genéticos de qualidade superior Teor de açúcares Teor de fibras Melhoramento genético prioridade

8 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA A cana-de de-açúcar Variedades RB Programa Nacional de Melhoramento de cana-de-açúcar conduzido pela RIDESA Produtividade Adaptação

9 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA Micropropagação Processo Benefícios

10 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA Sistemas de micropropagação

11 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA Sistemas de micropropagação

12 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA

13 Estresse INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA Cultivo in vitro x Cultivo em casa de vegetação e campo Estresse do cultivo in vitro Eu-estresse Dis-estresse

14 Estresse INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA Estresse oxidativo ROS O 2 - H 2 O 2 OH - Mensageiro molecular Morte celular

15 Estresse INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA Controle do nível de ROS ação de enzimas antioxidantes Superóxido desmutase (SOD) Catalase (CAT) Peroxidade (POD) Compostos sequestradores de radicais livres 2,2 difenil-1-picrilhidrazila atividade antioxidativa

16 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA Fidelidade genética Micropropagação Mesmo genótipo da planta doadora Variações genéticas cultivo in vitro

17 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA Fidelidade genética Mudanças epigenéticas e genéticas Variação somaclonal Nº cromossômico, deleções, rearranjos no genoma e substituição de nucleotídeos

18 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA Fidelidade genética Polimorfismo nos cinco subcultivos cultura de meristemas de cana-de-açúcar (ZUCCHI et al., 2002) Faixa esperada (SKIRVIN et al., 1994) Influência do genótipo diferenças nas variedades estudadas

19 INTRODUÇÃO E SÍNTESE DE LITERATURA Fidelidade genética Variações somaclonais não podem ser previstas Aumento na utilização de sistemas de micropropagação monitoramento das variações Detecção de polimorfismos de DNA amplificado (RAPD) Os marcadores (sob efeitos) tecidos e estádios de desenvolvimento

20 OBJETIVOS Objetivo geral Avaliar, por meio de análises bioquímicas e moleculares, a produção de mudas de cana-de-açúcar micropropagadas pelo sistema convencional e por imersão temporária.

21 OBJETIVOS Objetivos específicos Aferir o nível de estresse a que está submetido o material vegetal; Definir o nível de eu-estresse adequado à otimização do processo micropropagativo utilizando análises bioquímicas e suas correlações com parâmetros de crescimento;

22 OBJETIVOS Objetivos específicos Avaliar a fidelidade genética das mudas produzidas nos dois sistemas de micropropagação por meio da detecção das taxas de variação somaclonal ao longo dos sucessivos subcultivos; Correlacionar os efeitos dos reguladores de crescimento, utilizados nas distintas fases do cultivo in vitro, sobre o nível de estresse e a ocorrência de variação somaclonal.

23 METAS Inocular ápices caulinares de cana-de-açúcar de variedades RB em meio de cultivo semi-sólido e em Sistema de Imersão Temporária; Multiplicar o material inoculado tanto no Sistema Convencional quanto no Sistema de Imersão Temporária; Avaliar o crescimento a cada subcultivo e coletar plantas para análises bioquímicas e moleculares;

24 METAS Definir o estresse a que estão submetidas às plantas em ambos os sistemas de micropropagação, por meio de avaliação das atividades enzimáticas e da quantificação da produção de radicais livres; Detectar a taxa de variação somaclonal por meio de marcador molecular (RAPD);

25 METAS Analisar os resultados visando caracterizar e comparar os dois sistemas de micropropagação a fim de definir o que resulta em menor taxa de variação somaclonal associando este dado ao nível de estresse in vitro ao qual as plantas micropropagadas são submetidas.

26 METODOLOGIA Material vegetal RB RB Biofábrica Governador Miguel Arraes

27 METODOLOGIA Cultivo in vi tro Segmentos apicais (10 cm) Detergente neutro Álcool 70% Segmentos de 2 cm Tríplice lavagem Hipoclorito de sódio (3%) Inoculação

28 METODOLOGIA Estabelecimento Multiplicação 0,3 mg.l -1 de BAP 0,1 mg. L -1 de AIA Meio convencional Sistema de imersão temporária GA 3 GA 3 0,2 mg.l -1 de BAP 1,0 mg.l -1 de AIA 0,2 de BAP 1,0 de AIA

29 METODOLOGIA Sala de Crescimento 27 ± 2 C Fotoperíodo16 horas Intensidade luminosa de 47 µmol m -2 s -1. Análises bioquímicas e moleculares Nitrogênio líquido Freezer a -80ºC

30 METODOLOGIA Avaliação do crescimento (a cada subcultivo) Produção de biomassa fresca Número de plantas Tamanho médio

31 METODOLOGIA Estudo da atividade anti-radicalar Extratos brutos (0,5 mg.ml -1 ) Tubos de ensaio 5 ml de 2,2-difenil- 1-picrilhidrazila (100 mm EtOH) Agitação (30 min.) em aparelho de ultra-som

32 METODOLOGIA Quantificação de radicais de DPPH UV-Vis comprimento de onda de 517nm Eficiência anti-radicalar regressão linear (GraphPad Prism 4.0)

33 Enzimas antioxidantes METODOLOGIA Catalase CAT 15 µl do extrato 1 ml do tampão fosfato de potássio 100 mm (ph7,5) + 2,5 µl de H 2 O 2 30% Decomposição do H 2 O 2 por 1 min. Espectrofotômetro (240nm) 25ºC

34 METODOLOGIA Ascorbato peroxidase APX 50 µl do extrato 650 µl do tampão fosfato de potássio 80 mm (ph7,0) µl de ascorbato (5mM) µl de EDTA (1mM) µl de H 2 O 2 1mM Banho-maria a 30ºC Espectrofotômetro (290nm)

35 METODOLOGIA Superóxido dismutase SOD: Gel de poliacrilamida 5 µl de SOD bovina Coloração Azul de nitro tetrazólio (NBT) e riboflavina (CAKMAK E HORST, 1991)

36 Peroxidase POD METODOLOGIA Processadas tampão fostato 0,2 M (ph 6,7) à 0-4ºC Centrifugado por 15 min a g Adição de solução H 2 O 2 e fenol banho-maria (5 min) Etanol Atividade expressa em mol de H 2 O 2 decomposto

37 METODOLOGIA Polifenoloxidase PPO: Será determinada pelo mesmo método da peroxidase.

38 METODOLOGIA Fenóis totais 1 ml de extrato metanólico Reagente de Folin-Ciocalteu + carbonato de sódio (75 g.l -1 ) 30 minutos Leitura em espectrofotômetro UV-Vis a 20ºC a 765 nm

39 METODOLOGIA Análises moleculares Extração de DNA 300 mg macerada em almofariz contendo nitrogênio Adição de 800 µl de tampão de extração Lavagem em clorofórmio-álcool isoamílico (centrífuga por 5 min a rpm Aquecimento a 65ºC 40 min Adição de álcool isopropílico Repouso de 2 h

40 METODOLOGIA Centrifugação por 10 min a rpm Re-suspensão em 300 µl de tampão Re-precipitação do DNA com NaCl (5M) e isopropanol Contendo RNAse (40 µg. ml -1 ) Centrifugação por 10 min Extração avaliada em minigel de agarose 8% a 80 volts por 30 min

41 Reações de Amplificação METODOLOGIA Termociclador Programa 40 ciclos Etapa de desnaturação a 94ºC (15 seg) Ciclo final de 72ºC (7 min) Etapa de extensão a 72ºC (60 seg) Etapa de ligação do iniciador a 35ºC ( 30 seg) Separação em eletroforese 100 volts (4h) em gel de agarose 1,2% com 10 ml -1 de brometo de etídio

42 METODOLOGIA Visualização das bandas Luz ultravioleta Ausência e presença de bandas específicas comparadas ao padrão detecção de variantes somaclonais

43 Análise dos dados obtidos METODOLOGIA As médias dos somaclones obtidos serão calculadas, para cada subcultivo em cada sistema de micropropagação e as diferenças serão analisadas utilizando-se o teste do Qui-quadrado (SOKAL e ROHLF, 1981).

44 CRONOGRAMA M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D J F ATIVIDADES Revisão bibliográfica x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Inoculação de ápices x x caulinares Estabelecimento dos sistemas de micropropagação x x Subcultivos x x x x x x x x x x x x x Coleta de amostras x x x x x x x x x x x x x Avaliação de crescimento/ multiplicação x x x x x x x x x x x x x Análises bioquímicas x x x x x x x Análises moleculares x x x x x x x Elaboração de artigos para eventos científicos x x x Elaboração do relatório x Escrita da dissertação x x x x x Defesa da dissertação x

45 ORÇAMENTO Materiais Nitrato de potássio Nitrato de amônia Cloreto de Cálcio Fosfato de potássio monobásico Peróxido de hidrogênio EDTA 6-benzilaminopurina Ácido giberélico Ácido indolácetico Sacarose Aga bacteriológico Kit de extração de DNA Lâmina para bisturi nº11 Nitrogênio líquido Tubo eppendorf 1,5 ml Etiqueta Fita crepe Luva de procedimento tam. P Papel alumínio Plastfilm TOTAL Unidade Kg Kg Kg Kg litro Kg Grama Grama Grama Kg Kg Caixa Litro Caixa Pacote Unidade Caixa Unidade Unidade Quantidade V. unitário (R$) V. total (R$) ,00 338,00 18,00 58,00 18,00 110,00 122,50 233,90 112,00 24,00 520,00 765,00 22,00 8,50 17,50 1,39 3,20 12,00 2,15 2,15 338,00 338,00 18,00 58,00 36,00 110,00 122,50 233,90 112,00 120,00 520,00 765,00 66,00 425,00 35,00 6,95 16,00 12,00 32,25 21, ,10

46 RELEVÂNCIA E IMPACTO NO DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO, TECNOLÓGICO E SÓCIO-ECONÔMICO Utilização de variedades RB (Programa Nacional de Melhoramento da cana-de-açúcar + micropropagação 30% de produtividade Sistema de imersão temporária 1 milhão de mudas/mês Renovação de até ha entre 2009 e 2012 Avaliação dos fatores estressantes moleculares análises bioquímicas e

47 RELEVÂNCIA E IMPACTO NO DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO, TECNOLÓGICO E SÓCIO-ECONÔMICO Avaliação molecular genética das mudas controle da sanidade e da fidelidade Caracterização do nível de estresse avaliar até que ponto o estresse pode estar correlacionado à variação somaclonal Contribuir para que os agricultores obtenham mudas geneticamente fiéis

48 APOIO FINANCEIRO E INSTITUCIONAL

49 O eu-estresse estresse na micropropagação da cana-de de-açúcar: variáveis bioquímicas e moleculares Gemima Manço de Melo Mestranda do Programa de Pós-graduação em Agronomia Melhoramento Genético de Plantas PPGAMGP da Universidade Federal Rural de Pernambuco gemimamelo81@yahoo.com.br