UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA MELHORAMENTO GENÉTICO DE PLANTAS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA MELHORAMENTO GENÉTICO DE PLANTAS CITOGENÉTICA DA MANDIOCA E SEU USO COMO FERRAMENTA PARA O MELHORAMENTO GENÉTICO Mestranda: Kaliny Veiga Pessoa da Silva Orientador: Prof. Dr. Reginaldo de Carvalho Co- orientador: Dr. Alfredo Augusto Cunha Alves

2 ROTEIRO: 1- Introdução 2- Objetivos 2.1- Objetivo geral 2.2- Objetivos específicos 3- Metas 4- Metodologia 5- Resultados esperados 6- Cronograma 7- Orçamento 8- Relevância e impacto no desenvolvimento científico tecnológico e sócio-econômico

3 INTRODUÇÃO Manihot (Euphorbiaceae) 98 espécies Brasil: 80% das espécies Maior centro de diversifição

4 Perda de diversidade genética do gênero Introdução de poucas variedades melhoradas, destruição do habitat natural Levantamento realizado entre (NASSAR, 2006): 41 populações de 18 espécies na região central Apenas uma população permanece preservada à ca. 20 km de Brasília-DF

5 M. esculenta Crantz - Uma das cinco culturas alimentares mais difundidas do mundo - Utilizada na produção de: Féculas, farinha, papel, papelão, borracha e álcool

6 Região Nordeste: Carência de culturas adaptadas às condições edafoclimáticas Um dos principais alimentos consumidos na região Cultura praticada especialmente em nível de subsistência

7 Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical Cruz das Almas (BA) Maior banco de Germoplasmas de mandioca Mais de 20 espécies silvestres e centenas de acessos de mandioca MANDISILVESTRE Parceria com a UFRPE

8 Manihot - Alotetraplóides /2n=36, número básico x=9 Técnicas clássicas de bandeamento cromossômico e hibridização in situ fluorescente (FISH) Cromossomos micrometricamente pequenos e de difícil análise

9 CMA/ DAPI, DNAr 45S e 5S e BAC Utilizados em outras culturas Identificação das cultivares utilizadas Geração de padrões de bandas na espécie cultivada Evolução e origem diplóide ou tetraplóide localização de genes de importância agronômica

10 Estudo do comportamento meiótico das espécies de Manihot Coloração convencional Avaliação prévia dos acessos incluídos nos programas de melhoramento genético Reduzir significativamente o ônus dos programas

11 OBJETIVOS Objetivo geral Analisar o comportamento meiótico de espécies do gênero Manihot e mapear fisicamente o cariótipo da mandioca (Manihot esculenta Crantz)

12 Objetivos específicos - Analisar o comportamento meiótico de cultivares de mandioca e de espécies silvestres selecionadas para cruzamento - Identificar e quantificar as alterações cromossômicas numéricas e estruturais entre os cariótipos - Analisar o percentual de viabilidade dos grãos de pólen dos materiais selecionados

13 - Selecionar BACs de seqüências repetitivas -Selecionar BACs com características agronômicas importantes por seqüências análogas - Verificar homologias com outras espécies - Localização dos loci de DNA 45S e 5S e das regiões ricas em AT e GC

14 METAS - Coletar e caracterizar espécies, do gêneros Manihot, oriundos do banco de germoplasma da Embrapa CNPMF - Preparar as lâminas - Aplicar a técnica de coloração com os fluorocromos CMA e DAPI - Hibridizar in situ as sondas de DNAr 5S e 45S

15 - Obter e manter os clones contendo os BACs - Padronizar a técnica de FISH para BACs em Manihot esculenta - Isolar os BACs selecionados e construir as sondas por nick translation - Hibridizar os BACs - Construir o mapa físico para mandioca

16 METODOLOGIA Material vegetal Manihot esculenta manipeba e Pornunça além das espécies M. dichotoma, M. flabelifolia, M. leptophyla e M. peruviana e M. caerulescens

17 Pré-tratamento e Fixação Raízes pré-tratadas - 8-hidroxiquinoleína (2mM) por 24 horas a 10 o C Fixadas em Carnoy 3:1 (etanol: ácido acético glacial) - 24 horas Acondicionadas no freezer a 20 ºC / botões florais fixados diretamente

18 Análise convencional Lâminas preparadas pela técnica do esmagamento em ácido acético 45% Congeladas em nitrogênio líquido para remoção da lamínula Coradas com Giemsa 2%, ou hematoxilina 1% (Guerra e Souza, 2002)

19 Análise meiótica e o percentual de irregularidade avaliados por: 5 indivíduos e cinco lâminas de indivíduos Análise de viabilidade de pólen - Anteras coradas diretamente com carmim acético 2% Grãos de pólen - Coloração intensa no citoplasma - Viáveis - Ausência de coloração Estéreis

20 Caracterização das regiões heterocromáticas Raízes digeridas em enzimas Lâminas envelhecidas por três dias Coradas com CMA (0.5 mg/ml) por 1h e contracoradas com DAPI (2 µg/ml) por 30 min (Guerra e Souza,2002)

21 Lâminas serão descoradas em Carnoy 3:1 (etanol absoluto: ácido acético glacial) por 30 min Seguido de etanol absoluto por 1-2 h Estocadas a -20 C, para uso na hibridização in situ

22 Hibridização in situ Sítios de DNAr 5S e 45S Sonda D2, 500 pb, DNAr 5S de Lotus japonicus Sonda R2, 6,5 kb - unidade de repetição 18S-5,8S- 25S de Arabidopsis thaliana BACs serão disponibilizados pelo CIAT - Previamente selecionados

23 Marcação das sondas Extração plasmidial Marcação com Cy3-dUTP (Amersham) - Através de Nick Translation Hibridização in situ será realizado de acordo com Pedrosa-Harand et al (2006)

24 Hibridização in situ fluorescente

25 Fotodocumentação Microscópio de epifluorescência Leica DMLB - Câmera digital Cohu Medições cromossômicas e processamento de imagens serão realizados utilizando o Image Tool e o Corel Draw 12

26 RESULTADOS ESPERADOS Contribuir com informações relevantes para o programa de cruzamento e geração de híbridos de mandioca Gerar informações sobre a base genética das espécies silvestres Publicar pelo menos um artigo científico Qualis A Adquirir autonomia e familiarização com as técnicas propostas

27 CRONOGRAMA

28 ORÇAMENTO

29 RELEVÂNCIA E IMPACTO NO DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO, TECNOLÓGICO E SÓCIO-ECONÔMICO Brasil - Maior produtor de mandioca do continente americano Mandioca ou macaxeira se destaca por sua importância nutricional Tradicional na dieta da população rural e urbana

30 Colaboração para os programas de melhoramento genético da mandioca - Caracterização genética das espécies de Manihot Contribuição com melhoristas - Planejamento das estratégias de cruzamentos para geração de híbridos Marcadores citomoleculares aplicados a culturas como a mandioca é importante no estudo da diversidade genética

31 Geração de novos dados relativos a cultura Auxilio as estratégias e o estabelecimento dos programas de melhoramento Benefícios aos pequenos agricultores pela introdução de novas variedades mais adaptadas a nossa região

32 Kaliny Veiga Pessoa da silva Msc. Pós-graduação em agronomia melhoramento genético de plantas UFRPE