90 Circular. Técnica. Autores. Seleção de Marcadores do Tipo Rapd para Caracterização Genética Ricinus communis L. Introdução

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1 1 ISSN Seleção de Marcadores do Tipo Rapd para Caracterização Genética Ricinus communis L. 90 Circular Técnica Campina Grande, PB Dezembro, 2005 Autores Marcia Soares Vidal D.Sc., Bióloga, Embrapa Algodão, CEP , Campina Grande, PB. Máira Milani M.Sc., Eng. Agr., Embrapa Algodão. Carlos Henrique Salvino G. Meneses Estagiário da Universidade Estadual da Paraíba Cíntia de Sousa Bezerra Estagiário da Universidade Estadual da Paraíba, CEP , Campina Grande, PB. Introdução A demanda industrial por óleos vegetais cresce a cada ano e o interesse mundial pelos oleoquímicos (ácidos graxos, ésteres graxos metílicos, álcoois, glicerina e aminas graxas) está em alta, haja vista a sua diversificada forma de aplicações, usados na indústria de transformação em três fases, como matéria-prima industrial na síntese de produtos intermediários e em aplicações finais (FREIRE, 2001). O óleo da mamona (Ricinus communis) é a base para a obtenção de uma linha diversificada de matérias-primas utilizadas na fabricação de plásticos e plastificantes, fibras sintéticas, tintas, esmaltes, coberturas protetoras, resinas, lubrificantes e biodiesel. A partir da ricinoquímica, que é a química do óleo de mamona, pode-se chegar à geração de outros produtos bem mais sofisticados, como as próteses humanas, e dos produtos utilizados nas indústrias farmacêuticas, de cosméticos e aeronáutica (SAVI FILHO e BANZATTO, 1983). No Brasil, a ricinocultura está amplamente distribuída, destacando-se o cerrado, com produção altamente mecanizada, e no Nordeste, com o papel social de grande relevância, assegurando uma contínua fonte de renda, sustentada sob o modelo do triconsórcio (feijão, milho e mamona). Segundo Beltrão et al. (2001), há ocorrência de centenas de cultivares de mamona, como Sipeal 28, IAC 38, Campinas, BRS 149 (Nordestina), BRS 188 (Paraguaçu), Guarani, Baker 415-9, LC 5116, IAC 80, EPABA 02, Azeitona, Sangue-de-boi, Canela-de-juriti e Anã CIA, entre outras, além da existência de híbridos como Baker H. 66, Baker H. 72, híbrido 415, dentre outras cultivares. Algumas das diferenças entre os acessos residem na grande variação no hábito de crescimento, cor da folhagem e caule, tamanho das sementes, conteúdo do óleo e coloração e porte. A Embrapa Algodão formou, por intermédio da equipe de Melhoramento Genético de Plantas e do Laboratório de Biotecnologia de Plantas, um Banco Ativo de Germoplasma para trabalhos de melhoramento genético, propagação in vitro e caracterização molecular da cultura. Os estudos de caracterização, através de marcadores moleculares em associação com avaliação da

2 2 Seleção de Marcadores do Tipo Rapd para Caracterização Genética Ricinus communis L. divergência genética nesta espécie, são bastante limitados; deste modo o presente trabalho teve, como principal meta, selecionar oligonucleotídeos do tipo RAPD, com padrão de bandas polimórficas para caracterização molecular dos acessos existentes no BAG da mamoneira da Embrapa Algodão, permitindo que se verifique a similaridade entre eles, a fim de sanar dúvidas quanto à origem e ao uso nos cruzamentos, além de auxiliar na escolha de acessos potenciais para o enriquecimento da variabilidade genética no próprio Banco Ativo de Germoplasma. O uso combinado de marcadores morfológicos e moleculares subsidiará os trabalhos de melhoramento por meio da avaliação da variabilidade genética, seleção de indivíduos superiores e identificação de materiais genéticos promissores, para lançamento comercial, como de cultivares mais produtivas e com características de qualidade que atendam as demandas do setor produtivo contribuindo, ainda, para o intercâmbio de material e de informações entre instituições de pesquisa. A essência deste processo está em quanto o fenótipo de um indivíduo expressa o seu genótipo; é neste ponto que o uso de marcadores moleculares pode auxiliar o melhoramento de plantas, visto que possibilita acessar diretamente o genótipo de um individuo permitindo assim, o monitoramento e a organização da variabilidade genética, a seleção assistida por marcadores moleculares e a proteção de cultivares (MILACH, 1998). Material e Métodos Material Vegetal O material estudado se compunha de sementes de cinco acessos de mamona, provenientes do Banco Ativo de Germoplasma da Embrapa Algodão: Guarani, procedente do programa de melhoramento genético da mamona do Instituto Agronômico de Campinas (IAC); SMS Pernambucana e Nordestina, oriundas do programa de melhoramento genético da mamona da Embrapa Algodão - Campina Grande; CSRN 379, oriunda do programa de melhoramento genético da mamona da COSTA SEM - Costa Rica; CM 2000, procedente das coletas realizadas pelos pesquisadores do programa de melhoramento genético da mamona da EMBRAPA Algodão - Campina Grande). Sementes de cada um dos genótipos foram germinadas em copos plásticos de 500mL contendo substrato e mantidos em câmara de crescimento a 25ºC, até a obtenção do material para extração, exceto o acesso CM2000, coletado a campo, de uma planta adulta. Extração de DNA genômico O DNA genômico foi extraído segundo protocolo descrito por Ferreira e Grattapaglia (1998), com algumas modificações. As folhas permanentes em estádio inicial de desenvolvimento, recém-coletadas, foram maceradas em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml em presença de nitrogênio líquido, com o auxílio de bastão de vidro. Adicionaram-se, em seguida, 600 ml de tampão de extração (CTAB 2%; NaCl 1,4 M; EDTA 0,02 M; Tris-HCl 0,1 M, ph 8,0; PVP 2%, b- mercaptoetanol 0,2%), aquecido a 65ºC. As amostras foram submetidas a agitação e incubadas a 65ºC durante 30 minutos, sendo agitadas por inversão, a cada 5 minutos; após o resfriamento do extrato, a temperatura ambiente, adicionaram-se 600 ml de CIA (clorofórmio álcool isoamílico, 24:1) para formar uma emulsão; após de centrifugar-lo durante 10 minutos, a 4ºC e g, a parte superior aquosa (600 ml) foi transferida para novos tubos nos quais foram adicionados 600 ml de isopropanol (-20ºC), o que ocasionou a precipitação do DNA. O material foi incubado em freezer -20ºC por, pelo menos, 30 minutos, centrifugado pelo tempo de 10 minutos, a 4ºC e g, lavado com 500 ml de etanol 70% e 300 ml de etanol 95%, para remover sais e seco a temperatura ambiente, até a total evaporação do álcool do tubo. O DNA foi ressuspendido com 200 ml de água MilliQä contendo 10 mg/ml de RNAse A e incubado por 30 minutos, a temperatura ambiente; em seguida, adicionaram-se 200 ml de clorofórmio-álcool isoamílico 24:1 e os tubos foram agitados por inversão durante 5 minutos até se obter uma emulsão homogênea; após se centrifugar por 5 minutos a 4ºC e g, transferiu-se a parte superior aquosa (200 ml) para novo tubo no qual foram adicionados 20 ml de NH 4 OAc 3,5 M, homogeneizado e adicionados 500 ml de isopropanol frio (-20ºC), o que ocasionou a precipitação do DNA. O material foi colocado em freezer (-20ºC) por pelo menos 30 minutos sendo, centrifugado durante 10 minutos, a 4ºC e g, lavado com 500 ml de etanol 70% e 300 ml de etanol 95%, para remover sais e seco a temperatura ambiente. O DNA foi ressuspendido com 100 ml de água MilliQä e a concentração de DNA foi estimada pela migração das amostras em gel de agarose [agarose 0,8%, tampão TBE 1X (Tris-borato 0,09mM, EDTA 0,002M, ph 8,0) e brometo de etídio (0,012 ng/ml)]

3 3 visualizadas em transiluminador (Hing Performace Ultraviolet Transilluminator) e documentadas. Foi aplicado 1 ml de cada um dos DNAs totais isolados juntamente com 2 ml de tampão de amostra (sacarose 4 g, azul de bromofenol 0,025 g) e 7 ml de água MilliQä, que foram então comparados com o DNA do bacteriófago lambda (25 ng, 50 ng e 100 ng). Reações RAPD Após a quantificação, as amostras foram diluídas para 5 ng/ml com água MilliQä e armazenadas a -20ºC. Utilizaram-se oligonucleotídeos com 10 pares de base, pertencentes aos kits OPA, OPE, OPM, OPN e OPP (OPERON Technologies, Inc. Alameda, CA), totalizando 67 oligonucleotídeos, cujas reações foram desenvolvidas em volume final de 25 ml, contendo Tampão PCR 1X (0,2 M de TRIS-HCl ph 8,4; 0,5 M de KCl); 3,0 mm de MgCl 2; 0,2 mm de dntp; 0,3 µm do oligonucleotídeo arbitrário; 1 ml de Taq DNA polimerase, produzida no Laboratório de Biotecnologia, e 10 ng do DNA genômico. As amplificações foram realizadas em termociclador Eppendorf - Mastercycle, sendo a temperatura elevada para 94º C durante 5 minutos e, em seguida, realizados 44 ciclos com a seguinte programação: 1. 94ºC por 60 segundos; 2. 35ºC por 60 segundos e 3. 72ºC por 2 minutos; terminados os 44 ciclos, a temperatura permaneceu a 72ºC por 5 minutos para a completa extensão dos produtos amplificados baixando em seguida para, 4ºC. As reações foram acrescentados 4mL de tampão de carreamento (sacarose 4 g, azul de bromofenol 0,025g) e, os produtos amplificados foram submetidos a eletroforese horizontal, em gel de agarose [agarose 1%, tampão TBE 1X e brometo de etídio) visualizados em transiluminador e fotografados em equipamento de foto documentação. Aplicou-se, como marcador de peso molecular, o DNA do bacteriófago lambda, digerido com PstI no início e no final do gel, para definir o tamanho aproximado dos fragmentos gerados nos PCRs. realizadas com os oligonucleotídeos OP-E10, OP-E13, OP-P03, OP-P10, OP-P18, OP-P20 e OP-M09 geraram dados não conclusivos, razão por que foram eliminadas das análises. As reações com esses oligonucleotídeos devem ser refeitas, de modo a gerar dados mais consistentes que possam ser, então, empregados na seleção de novos marcadores do tipo RAPD. Os oligonucleotídeos que geraram marcadores de DNA e puderam ser analisados com os respectivos números de bandas, número de bandas que foram polimórficas entre os acessos analisados e as seqüências dos oligonucleotídeos utilizados, estão apresentados nas Tabelas 1, 2, 3 e 4. Na Tabela 1 podem-se observar os resultados obtidos com os oligonucleotídeos da série OP-E, na qual se nota que 143 bandas puderam ser analisadas, sendo que 32 foram polimórficas. Dos 16 oligonucleotídeos testados da série OP-E, os que apresentaram maior número de fragmentos polimórficos foram os OP-E 04 e OP-E 18, ambos com 4 loci polimórficos, enquanto o oligonucleotídeo OP-E 06 não apresentou qualquer banda polimórfica. A partir dos dados da Tabela 2, pode-se observar que os resultados obtidos com os oligonucleotídeos da série OP-P, diferiram bastante dos resultados das Tabelas 1 e 4 no que se diz respeito ao número de bandas polimórficas, enquanto na Tabela 2 se nota que 114 bandas foram analisadas, mas somente 13 foram polimórficas; dos 17 oligonucleotídeos testados da série Tabela 1. Número de marcadores do tipo RAPD E), número de bandas analisadas, número de bandas Resultados e Discussão Dos 77 oligonucletídeos testados com os kits OPA, OPE, OPM, OPN e OPP, 47 produziram o total de 105 bandas polimórficas. Nesta análise foram eliminadas bandas fracas e que não pudessem gerar dúvidas com relação à genotipagem. Os oligonucleotídeos OP-E05, OP-E08 e OP-M01 não amplificaram nenhuma das amostras empregadas nas reações de RAPD e as reações

4 4 Seleção de Marcadores do Tipo Rapd para Caracterização Genética Ricinus communis L. Tabela 2. Número de marcadores do tipo RAPD P), número de bandas analisadas, número de bandas Tabela 3. Número de marcadores do tipo RAPD M e OP-A), número de bandas analisadas, número de bandas OP-P, o que apresentou maior número de locus polimórficos foi o OP-P 17, com 5 loci polimórficos, enquanto os oligonucleotídeos OP-P 01, OP-P 02, OP-P 03, OP-P 04, OP-P 07, OP-P 11, OP-P 12, OP-P 13, OP-P 14 e OP-P 5 não geraram nenhuma banda polimórfica, sendo a série que apresentou a menor média de bandas com padrão polimórfico (0,76). Tabela 4. Número de marcadores do tipo RAPD N), número de bandas analisadas, número de bandas Na Tabela 3 observam-se os resultados obtidos com os oligonucleotídeos da série OP-M e OP-A, em que 87 bandas foram analisadas nas séries OP-M e 15 na OP-A, sendo que 19 da série OP-M e 6 da série OP-A foram polimórficas. Dos 14 oligonucleotídeos testados da série OPM os que forneceram maior número de fragmentos polimórficos foram os OP-M 04, OP-M 07, OP-M 13 e OP-M 14, todos com 3 loci polimórficos; já os oligonucleotídeos OP-M 03, OP-M 06, OP-M 08, OP-M 11 e OP-M 20 não apresentaram banda polimórfica. Ainda na Tabela 3 verifica-se que dos dois oligonucleotídeos testados da série OP-A, o que apresentou maior número de fragmentos polimórficos foi o OP-A 03, com 5 bandas. Os resultados obtidos com os oligonucleotídeos da série OP-N podem ser visualizados na Tabela 4, na qual 110 bandas puderam ser analisadas, dentre elas 35 foram polimórficas; dos 18 oligonucleotídeos testados da série OP-N, o que apresentou maior número de bandas polimórficos foi o OP-N 01, com 7 loci polimórficos, também sendo o oligonucleotídeo que mostrou maior número de bandas polimórficas, dentre todos os testados. Os oligonucleotídeos OP-N 11, OP-N 12, OP- N 16 e OP-N 18 desta série não mostraram padrões de bandas polimórficas. Conclusão Com este trabalho, foi concluído que:

5 5 Os 47 oligonucleotídeos da linha OPERON, capazes de gerar bandas com padrão polimórfico; Os marcadores moleculares do tipo RAPD mostraram-se eficientes para detectar polimorfismo nessa espécie e podem ser utilizados como uma poderosa ferramenta na obtenção de informações úteis para o manejo do Banco Ativo de Germoplasma e para o direcionamento de programas de melhoramento genético da cultura da mamona; Referências Bibliográficas BELTRÃO, N.E. de M.; SILVA, L.C.; VASCONCELOS, O.L,; AZEVEDO, D.M.P. de; VIEIRA, D.J. Fitologia. In: AZEVEDO, D.M.P. de; LIMA, E.F. O agronegócio da mamona no Brasil. Brasília, Embrapa Informação Tecnológica, p FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3 ed. Brasília: EMBRAPA, p. FREIRE, R.M.M. Ricinoquímica. In: AZEVEDO, D.M.P.; LIMA, E.F. O agronegócio da mamona no Brasil. Brasília, Embrapa Informação Tecnológica, p MILACH, S.C.K. Marcadores de DNA - Aplicações no melhoramento de plantas. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, v. 5, p.14-17, SAVI FILHO, A.; BANZATTO, N.V. O mercado está para mamona. Casa da Agricultura, v. 5, n. 5, p , Circular Técnica, 90 Exemplares desta edição podem ser adquiridos na: Embrapa Algodão Rua Osvaldo Cruz, 1143 Centenário, CP Campina Grande, PB Fone: (83) Fax: (83) sac@cnpa.embrapa.br 1 a Edição Tiragem: 2000 Comitê de Publicações Presidente: Luiz Paulo de Carvalho Secretária Executiva: Nivia M.S. Gomes Membros: Cristina Schetino Bastos Fábio Akiyoshi Suinaga Francisco das Chagas Vidal Neto Gilvan Barbosa Ferreira José Américo Bordini do Amaral José Wellington dos Santos Nair Helena Arriel de Castro Nelson Dias Suassuna Expedientes: Supervisor Editorial: Nivia M.S. Gomes Revisão de Texto: Nisia Luciano Leão Tratamento das ilustrações: Geraldo F. de S. Filho Editoração Eletrônica: Geraldo F. de S. Filho