Material e Métodos Resultados e Discussão

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1 Área: Melhoramento Genético Vegetal TRANSFERIBILIDADE DE PRIMERS MICROSSATÉLITES DE Phaseolus vulgaris PARA Vigna unguiculata Matheus Felipe Nogueira da Silva 1, Leidiane Bezerra Albuquerque 2, Rafaela Priscila Antonio 3 ; Caio Henrique Fernandes 1, Paulo Sérgio Lima e Silva 3, Lindomar Maria da Silveira 4, José Torres Filho 4. 1 Aluno de Iniciação Científica, Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Mossoró, RN. [email protected]. 2 Mestranda em Fitotecnia, Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Mossoró, RN. 3 Prof. D.Sc. Genética e Melhoramento de Plantas, Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Mossoró, RN. 4 Prof. D.Sc. Fitotecnia, Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Mossoró, RN. Resumo Considerando o elevado custo necessário para o desenvolvimento de primers microssatélites, a transferibilidade dos mesmos entre espécies aparentadas é bastante apropriada. O objetivo deste trabalho foi verificar a transferibilidade de 62 primers SSR de regiões específicas de feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) em acessos de feijão-caupi (Vigna unguiculata). Para tal, um total de 62 primers SSR desenvolvidos para feijão comum foram testados em genótipos de feijão caupi. Estes genótipos são constituídos por acessos, sendo os mesmos divergentes quanto a diversas caracteríticas morfoagronômicas. Sementes de dois acessos de feijão caupi foram plantadas em casa de vegetação e 15 dias após a germinação e suas folhas foram coletadas para a extração de DNA, a seguir, cada amostra de DNA genômico total foi amplificada com os 62 pares de primers SSR. Nesta pesquisa foi obtida uma excelente taxa de transferibilidade de primers de P. vulgares para V. unguiculata. De todos os primers analisados, 26 encontraram homologia na espécie estudada, podendo ser então utilizados como ferramenta de auxílio nos programas de melhoramento para o feijão-caupi. Palavras-chave: Marcadores moleculares, variabilidade genética, reação de polimerização em cadeia. Introdução As leguminosas constituem uma das famílias botânicas mais conhecidas e de maior importância econômica, sendo formada por mais de espécies, dentre as quais podemos destacar a espécie Vigna unguiculata (L.) Walp. que é conhecida popularmente como feijão-de-corda, feijão-caupi ou feijão massacar (FREIRE FILHO et al.,.2005). Esta leguminosa é comumente cultivada nas regiões Norte e Nordeste do Brasil como fonte de renda, além de ser bastante utilizada para consumo uma vez que possui elevado valor nutricional servindo como um dos principais componentes da dieta da população (BERTINI et al., 2009). Devido a sua importância econômica, programas de melhoramento genético vêm sendo desenvolvidos na intenção de aumentar a eficiência produtiva desta leguminosa. Uma das formas mais eficientes de auxiliar os programas de melhoramento de espécies vegetais são os marcadores moleculares que consistem na análise de variabilidade genética por meio de diferenças mínimas em nível de DNA da espécie estudada. Dentre os diversos tipos de marcadores moleculares existentes, os microssatélites ou sequências simples repetidas do inglês Single Sequence Repeat (SSR) se destacam pela herança co-dominante e pelo seu elevado polimorfismo, sendo ainda de fácil interpretação. Marcadores SSR são sequências repetidas de um a seis nucleotídeos em tandem, sendo que os fragmentos de interesse são amplificados por meio de primers desenhados 1

2 especificamente para a região em estudo e amplificados via reação de polimerase em cadeia (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). Marcadores SSR, ao contrário de alguns outros marcadores como os Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), requerem o conhecimento prévio da sequência de DNA desejada, portanto, os primers necessitam ser previamente desenhados para cada loco de cada espécie, o que encarece o uso desta técnica (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). Vários trabalhos foram publicados mostrando que a transferibilidade de primers entre algumas espécies de mesma família tem sido realizada com sucesso (SCHIAVON et al., 2009; LEITE et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2010). Considerando o elevado custo para o desenvolvimento de marcadores microssatélites, a transferibilidade de primers entre espécies aparentadas, ou seja, de mesma família botânica pode ser uma alternativa para redução dos custos desta técnica. O objetivo deste trabalho foi verificar a transferibilidade de 62 primers SSR de regiões específicas de feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) em acessos de feijão-caupi (V. unguiculata). Material e Métodos Um total de 62 primers SSR desenvolvidos para feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) foram testados em genótipos de feijão caupi. Estes genótipos são constituídos por acessos, sendo os mesmos divergentes quanto a diversas caracteríticas morfoagronômicas. Sementes de dois acessos de feijão caupi foram plantadas em casa de vegetação e 15 dias após a germinação e suas folhas foram coletadas para a extração de DNA, conforme o protocolo de Doyle e Doyle (1990). A seguir, cada amostra de DNA genômico total foi amplificada com os 62 pares de primers SSR. Para cada reação de PCR foi utilizado um mix contendo 20 ı g de DNA, 100 µm de cada um dos dntps, 1U de taq DNA polimerase, tampão composto de 50 mm de TRIS ph 8,3, 20mM de KCl, 2mM de MgCl 2, 10µg de BSA, 0,25% de Ficoll 400, 10mM de tartrazine, 5mM de primer (2,5 mm de Forward e 2,5 mm de Reverse) e água ultrapura. O volume final para cada reação foi de 12µl. A amplificação foi realizada em termociclador modelo Mastercycler Eppendorf, no qual foi empregado o seguinte programa: cinco minutos, a 95ºC, para desnaturação do DNA; oito ciclos, em que foram usados 20 segundos, à temperatura de 94ºC para desnaturação; 20 segundos para anelamento do primer, cujas temperaturas foram de 46ºC a 68ºC de acordo com o primer; 1 minuto a 72ºC para extensão de DNA; 24 ciclos que diferiram dos primeiros apenas na temperatura de anelamento que variaram de 52ºC a 65ºC e uma extensão final, por quatro minutos, a 72ºC. Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese horizontal por 2 horas a 80 V em gel de agarose a 3% corado com brometo de etídio e fotografados com câmera digital. Na análise dos géis foram considerados os critérios adotados por Kuleung et al. (2004). Assim, foi construído um score para os primers que amplificaram fragmentos de tamanho esperado de acordo com a intensidade do sinal e a facilidade de avaliação: (1) sinal forte e facilidade de avaliação; (2) sinal fraco e facilidade de avaliação; (3) sinal fraco e difícil avaliação e (4) ausência de sinal. Resultados e Discussão Dos 62 primers testados em feijão-caupi, 26 apresentaram homologia (Tabela 1), o que corresponde a uma taxa de transferibilidade de aproximadamente 42%, esta taxa de transferibilidade é maior que a encontrada 2

3 por Leite et al. (2007) que foi de 31,25% em um estudo de transferibilidade de primers desenhados para melão em abóbora e bucha vegetal. Marcador Primer Marcador Primer Forward/Reverse Forward/Reverse X53603 BM16 5 TTT ACG CAC CGC AGC ACC AC3 5 TGG ACT CAT AGA GGC GCA GAA AG3 5 CAC CGG GAG TGGCTG ACA3 5 GTT TGG GGC GGA GTT CGA3 BM68 5 TTC GTT CAC AAC CTC TTG CAT T3 BM170 LBM 187 LBM199 LBM202 5 TGC TTG TTA TCT TGC CCA GTG3 5 AGC CAG GTG CAA GAC CTT AG3 5 AGA TAG GGA GCT GGT GGT AGC3 5 TTT CTC CAA CTC ACT CCT TTCC3 5 TGT GTT TGT GTT CCG AAT TAT GA 5 AAG GAG ATT CAG AGA AGC CAA AAG3 5 TGA GGA ATG GAT GTA GCT CAG G3 5 ATG CGA AAG AGG AAC AAT CG3 5 CCT TTA CCC ACA GCG CTT C3 BMD49 5 TCT CTT CCT TAC CCT GTT CTG C3 5 GGT TCA ATG CTG GCT GAG A3 BMD38 BMD40 AJ AJ PVM01 5 GCG TTT CCA TGA ATC AAT CC3 5 AAA TTC CGA ACC CGT GAA CT3 5 AAC CTT CTT GCG CTG ATC TC3 5 TAG TGG CCA TTC CTC GAT CT3 5 ACA GAG GAG AGA GAG AGA GAG3 5 GTA AAG GGA AAA AAG AAT CC3 5 ACT AGA GGA GAG ACG AGA GA3 5 GTA GCA AGT TGC AGG AGT3 5 GCT CTA GCC TCA ATC CTT GG3 5 GGT TCC TGC TTC CCA CTT T3 PVM03 5 CCG CCT TCT TCT TCT TCT TC3 5 CGG CGA GTC ATC TTT TCC3 PVM06 5 TTG CCA ACA AAT GGA AGT GA3 5 TTG CAC AAT GAG AAG GGA GA3 PVM07 5 CTG GAA TGG CTT ACA GAT GC3 5 CCA AGA TCA GGC ACA GTG AA3 PVM11 5 TGG GAT TTT GAG CGT GTG 3 5 TCC ACC GAC TTA CCG AAC A3 PVM12 5 CCA GTG TGT CAA CAA ATG GA3 5 AGG CTT AGG GAA TGG CTC A3 PVM13 5 GAG AAG CCG CAG AGA GGA3 5 AGA TGC CGC GAA CAG AAC3 PVM13 5 GAG AAG CCG CAG AGA GGA3 5 AGA TGC CGC GAA CAG AAC3 PVM15 5 GGT GGA GGC AGT GGT GTT3 5 TTC ACT TTC CCA AGA CCT GA3 PVM18 5 CAA CCA TCT CTG TGG CAA G3 5 TGA GTT TGG GAG AGT GAG TTT T3 PVM25 5 GAA GAC GTG AAG GAG CCA CT3 5 CAC TTT CCA GAG AGA ACG CAA T3 PVM28 5 GGT GGC AGG TAC GAA AGA GT3 PVM30 5 GCA GAC CCT GTC AAC AAC AA 3 5 GCC ATG AAG CAA GGT GAA GA3 PVM34 5 CTT CTC CCT CTT CCT CCT3 5 GGA CAG TGA TAG TTC AGA TTC3 A grande maioria das bandas amplificadas apresentaram um excelente padrão de amplificação sendo consideradas para esta análise apenas as bandas mais nítidas que apresentaram scores 1 e 2 (Figura 1). Testes de transferibilidade de primers SSR para feijão também foram realizados por Schiavon et al. (2009) que analisaram a transferibilidade de13 primers de soja em 42 genótipos de feijão comum, dos quais todos geraram produto de amplificação, no caso do presente trabalho ambos os indivíduos utilizados apresentaram produto de amplificação via PCR. Houve uma média de amplificação de 24,5 primers por indivíduo. 3

4 PVM06 PVM13 Figura 1 Padrão eletroforético de genótipos de feijão-caupi amplificados com os primers SSR PVM06 e PVM13 de P. vulgaris em gel de agarose a 3%. No presente trabalho, somente os scores 1 e 2 foram considerados como amplificação positiva. Na análise realizada, aproximadamente 42% dos primers testados produziram um perfil de bandas em pelo menos um dos genótipos de feijão. Já Schiavon et al. (2009) após a realização da análise exploratória observaram que 100% dos marcadores testados produziram um perfil de bandas para todos os genótipos de feijão testados em suas análises. Foram observados padrões distintos de bandas para a maioria dos 62 primers testados que amplificaram as amostras. Os resultados encontrados nesta pesquisa são considerados muito promissores para o uso de primers transferíveis dentro da família leguminosae, podendo ser utilizados em programas de melhoramento como ferramenta para seleção assistida por marcadores, identificação de QTLs, divergência genética entre acessos entre outras utilidades, o que tornaria possível a redução de tempo e de custos na execução destes tipos de pesquisa por não ser necessário o desenho de primers específicos para a cultura do feijão caupi. Conclusões Grande parte dos primers SSR utilizados nesta pesquisa podem ser utilizados como ferramenta para auxiliar nos estudos genéticos em feijão caupi. Nesta pesquisa foi obtida uma excelente taxa de transferibilidade de primers de P. vulgares para V. unguiculata. Referências BERTINI, C. H. C. M.. et al. Divergência genética entre acessos de feijão-caupi do banco de germoplasma da UFC. Ciência Agronômica, Fortaleza, v.1, p , DOYLE, I.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant from fresh tissue. Focus, Rockville, v.12, p.13-15, FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3.Ed. Brasília: EMBRAPA/CENARGEN, p. FREIRE FILHO, F. R.; RIBEIRO, V. Q. ; ALCÂNTARA, J. P. ; BELARMINO FILHO, J. ; ROCHA, M. M. BRS Marataoã : Novo cultivar de feijão-caupi com grão tipo sempre verde. Revista Ceres, Teresina, v.52, p , KULEUNG, C. ; BAENZIGER, P. S. ; DWEIKAT, I. Transferability of SSR markers among wheat, rye, and triticale. Theoretical Applied Genetics, v. 108, p

5 LEITE, T. L.; MARCO, A. F.; TARCHETTI, B. D.; FERREIRA, M. A. J. F.; AMARAL, Z. P. S.; BUSO, G. S. C. Análise de transferibilidade de primers microssatélites de Cucumis melo para Curcubita moschata e Luffa cylindrica. Brasília, Disponível em: Acesso em: 13 de Mar de OLIVEIRA, M. S. P., et al. Variabilidade genética entre acessos de açaizeiro utilizando marcadores microssatélites. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.34, p , SCHIAVON, A. L.; SANTOS, M. A.; SOUZA, R. C.; HUNGRIA, M. Transferibilidade de marcadores microssatélites de soja para feijão comum (Phaseolus vulgaris) In: IV Jornada acadêmica da Embrapa soja, n. 312, Lonrina, p