Endereço: Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro UENF. Av. Alberto Lamego 2000, CEP:

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1 Avaliação da Variabilidade Genética Via Marcadores ISSR Entre e Dentro de Populações de Milho Submetidas a Diferentes Ciclos de Seleção Recorrente Recíproca Carlos Diego de Oliveira Azevedo 1, Ana Paula C. Gabriel 1 e Messias G. Pereira 1 1 Endereço: Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro UENF. Av. Alberto Lamego 2000, CEP: carlosdiego_oliveira@yahoo.com.br Palavras-chave: ISSR, milho, seleção recorrente, distância genética e heterose. Introdução O milho é uma cultura de grande importância nutricional, sendo uma boa fonte de carboidratos para a dieta alimentar humana e animal e, por esse motivo está presente em quase todas as regiões agrícolas do mundo (Borém e Giudice, 2004). Este é o principal cereal cultivado no Brasil e o melhoramento genético tem sido responsável por incrementos espetaculares de rendimento nesta cultura, principalmente pela exploração do fenômeno da heterose, fator este, bastante expressivo nas plantas alógamas (Silva, 2003). Dentre os métodos de melhoramento aplicáveis à cultura do milho, merece destaque a seleção recorrente recíproca, proposto por Hallauer e Ebehart (1970). Esta metodologia permite, ao mesmo tempo, assegurar ganhos genéticos diretos (nas populações per si) e indiretos (nas populações em cruzamento). Neste contexto, a UENF vem conduzindo um programa de melhoramento de milho comum que visa à obtenção de híbridos interpopulacionais obtidos pelo cruzamento entre as populações CIMMYT e Piranão, as quais já foram submetidas a 12 ciclos de seleção recorrente recíproca. De acordo com Ferreira e Grattapaglia (1998) o avanço genético pode ser alcançado a partir do momento em que exista variabilidade genética na população a ser melhorada, e que o efeito ambiental não mascare por completo esta variabilidade. Já Amaral & Thiébaut (1999) complementam que a grande importância dos estudos de divergência genética está no conhecimento do grau de variabilidade genética das populações, em função da preocupação que ocorre com a erosão genética, que diminui a variabilidade das populações, decorrente, principalmente, das pressões de seleção aplicadas nos programas de melhoramento que visam resultados a curtos prazos, além da substituição de variedades mais antigas por populações geneticamente mais uniformes. Sendo assim, o presente trabalho visa monitorar a variabilidade genética entre e dentro das populações CIMMYT e Piranão nos diferentes ciclos de seleção recorrente uma vez que a partir do oitavo ciclo de seleção teve início a aplicação de marcadores moleculares na etapa de seleção dos genótipos a fim de favorecer a seleção de genótipos mais distantes geneticamente e assim, potencializar a heterose na obtenção dos híbridos interpopulacionais. 2651

2 Esta etapa adicional dos marcadores moleculares também visa aumentar o distanciamento genético entre as duas populações bem como ampliar a variabilidade dentro das mesmas de modo a aumentar a longevidade do referido programa de melhoramento. Material e Método O m aterial genético constitui-se de 26 indivíduos de cada uma das populações CIMMYT e Piranão e pertencentes a cada um dos três ciclos de seleção recorrente recíproca em estudo, totalizando 156 genótipos (Tabela 1). T a b ela 1 Intervalo de genótipos em cada população de cada ciclo de seleção. P o pulação/ Ci clo de seleçã o I nte rval o d e genóti pos C IMMY T Piranão C IMMY T Piranão C IMMY T Piranão O plantio foi realizado em casa de vegetação na unidade de apoio a pesquisa UAP - situada no campus da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, em Campos dos Goytacazes-RJ. As amostras das populações de milho de cada ciclo (6º, 8º e10º) foram acondicionadas em 25 vasos e, em cada um destes vasos foram plantadas 3 das 100 sementes selecionadas ao acaso de cada população. O 26º vaso constituiu o Bulk de cada população e nele foram plantadas as 25 sementes restantes. Estas plantas permaneceram em casa de vegetação por 40 dias para posterior coleta de seus tecidos foliares. Para tanto, foram coletados aproximadamente 200mg de tecido foliar de cada amostra, os quais, depois de colhidos, foram instantaneamente imersos em nitrogênio líquido e submetidos à maceração manual em cadinhos de porcelana com o uso de um pistilo do mesmo material e transferidos para tubos de capacidade 1,5 ml, cujo modelo é safe-lock e o fabricante é a empresa Eppendorf e, novamente imersos em nitrogênio líquido. Após a maceração, prosseguiu-se com o protocolo de extração mini-prep de Doyle e Doyle, 1990, modificado. Para avaliação da concentração e da qualidade de DNA as amostras foram avaliadas em gel de agarose 1,0% e foram coradas com GelRed. Como padrão foi utilizada amostra de DNA com concentração conhecida de DNA de fago λ (10, 20, 30, 50 e 100ng). As amostras de trabalho foram posteriormente padronizadas na concentração de 5 ng.µl -1 e mantidas a -20ºC. 2652

3 Para a Análise molecular via marcador ISSR (Seqüências Internas Simples Repetidas) os procedimentos descritos foram realizados de acordo com a metodologia sugerida por Zietkiewicz et al, (1994) com algumas modificações. Até o momento foram utilizados 7 primers da empresa Invitrogen com amplitude de temperatura de anelamento, entre 40 e 42ºC, as quais foram testadas no termociclador gradiente Eppenddorf (Tabela 2). As condições da Reação da Polimerase em Cadeia para um volume final de 20µL foram as seguintes: 2 µl de Tampão 10X (500 mm KCl, 100mM Tris-HCl ph 8,4, 1% de Triton X- 100); 0,5 µm de primer (100 µm); 2mM de MgCl 2 ; 100µM de cada dntp; 0,6U de Taq DNA polimerase; 1µL (5%) de DMSO e 2µL de DNA genômico (5ng/µL), completando o volume final com água ultrapura. Um controle negativo com omissão de DNA foi incluído em cada corrida para verificar a ausência de contaminação. T a b ela 2 Desenh o d o s Primers ISSR e respectivas Temperaturas de Anelamento. D e senho d os P r i me rs (CAC) 9 GC 42ºC (AG) 8 YT 40ºC (AG) 8 CG 42ºC (AC) 8 CT 40ºC (AC) 8 YG 40ºC (GGAT) 3 GA 42ºC (GAA) 6 AA 42ºC TMº As reações de amplificação foram realizadas no termociclador gradiente Eppendorf com o seguinte programa: Um ciclo de desnaturação inicial a 94 ºC por 4 minutos, seguido de 37 ciclos de amplificação de 94º por 1 minuto, TMº por 2 minutos, 72 ºC por 2 minutos, e uma extensão no último ciclo de 72 ºC por 7 minutos. Os fragmentos de DNA foram separados por eletroforese horizontal em gel de agarose 2,0% e tampão TAE 1X, a 70 volts por 3 horas e posteriormente corados com GelRed. O marcador Ladder de 100 pares de bases foi utilizado para a determinação do tamanho dos fragmentos gerados. Os géis foram fotodocumentados no sistema de revelação sob luz ultravioleta no equipamento Mini Bis Pro (BioAmérica). A partir da análise dos géis foi construída uma matriz binária, onde a presença de bandas é indicada pelo número 1 e a ausência pelo número 0. Essa matriz foi utilizada para calcular a matriz de dissimilaridade, considerando o complemento aritmético do índice de Jaccard, e, a partir desta matriz, obteve-se o agrupamento de UPGMA. A análise dos dados foi realizada pelo programa Genes e pelo programa R. 2653

4 Resultados e Discussão Com os 7 primers de ISSR utilizados até o momento foram gerados 60 fragmentos de DNA, os quais variaram em tamanho de 250 a 2250 pares de base, sendo que deste total 51 marcas foram polimórficas e 8 monomórficas. Os marcadores ISSR identificaram como genótipos mais distantes os de número 2 e 93, por apresentarem a maior distância, ou seja, 0, Em contrapartida, os genótipos 60 e 64 foram os mais similares, apresentando distância de 0, Este resultado está de acordo com o esperado, pois os genótipos 2 e 93 (maior distância: 0,75676) pertencem a populações e ciclos diferentes, quais sejam, população CIMMYT no sexto ciclo de seleção e população Piranão no oitavo ciclo de seleção, respectivamente, enquanto que os genótipos 60 e 64 (menor distância: 0,130403) pertencem à mesma população e ao mesmo ciclo de seleção, a saber: população CIMMYT 8. O diagrama de árvore contendo as diferentes populações gerado pelo método de Ward, (Figura 1), mostrou a formação de dois grandes grupos, e ainda demonstrou a formação de subgrupos. Ademais, ainda de acordo com dendrograma, percebe-se uma tendência de agrupamento principalmente em funçãodos grupos heteróticos, CIMMYT e Piranão, assim como um subagrupamento em função dos diferentes ciclos de seleção recorrente. Espera-se que com o acréscimo de outros primers, este agrupamento seja melhor visualizado, inclusive dando a indicação de preservação genética das populações e ainda, um acréscimo de variabilidade ao longo dos ciclos. Com a análise preliminar da variabilidade genética via marcadores ISSR, foi possível constatar que há variabilidade genética entre e dentro das populações de milho nos diferentes ciclos de seleção recorrente recíproca. No entanto, deve-se considerar a necessidade de se trabalhar com um maior número de primers. O número de marcas obtidas com estes primers ainda não é suficiente para a fidedignidade dos dados, ou seja, será necessário aplicar nas populações um maior número de primers, de modo que as populações se agrupem de maneira bem definida. 2654

5 Figura 1: Dendrograma dos 126 genótipos das populações dos diferentes ciclos de seleção recorrente obtido pelo método de Ward no Programa R. 1 a 26 C6; 27 a 52 P6; 53 a 78 C8; 79 a 104 P9; 105 a 130 C10 e 131 a 156 P10. XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD- Rom 2655

6 Referências Bibliográficas Borém, A.; Giudice, M. P., Del, 2004.In Tecnologia de produção o milho.galvão, J.C.C. e Miranda, G.V. 1ª ed. Viçosa: UFV.366P. Bull, L. T. e Cantarella, H., 1993.Cultura do Milho. 301p. Doyle, J.J. e Doyle, J. L., 1997.Isolation of plant DNA from fresh tissue.focus, v.12: Von Pinho, R. G., 2003.Produção de milho no Brasil e no mundo: Realidade e perspectiva.anais do Simpósio sobre Melhoramento e Perspectivas do Milho.Lavras: UFLA, 2003 XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD- Rom 2656