Tecnologia em Eucalyptus: Técnicas moleculares de transferência de primers heterológos em espécies e híbridos.

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1 Tecnologia em Eucalyptus: Técnicas moleculares de transferência de primers heterológos em espécies e híbridos. Hélio Sandoval Junqueira Mendes 1, Deise Reis de Paula 2 1 Biólogo, helio_junq@yahoo.com.br, 2 Bióloga, FCAV/UNESP O Brasil destaca-se no cenário mundial pela importância da biomassa florestal e suas potencialidades com uma das mais altas taxas de produtividade na silvicultura, atingindo entre 40 e 50 metros cúbicos (m 3 ) de madeira por hectare ao ano, mais de 10 vezes superior à observada em países de clima temperado (STAPE, 2003). A atividade de base florestal, presente em quase todo o território nacional, divide-se em vários segmentos, como: celulose e papel, papelão ondulado, siderurgia a carvão vegetal, móveis e madeira processada mecanicamente, que engloba a produção de madeira serrada, painéis reconstituídos, compensados e laminados e produtos de maior valor agregado, além de vários produtos não madeireiros. Em uma considerável área de reflorestamento no Brasil se utiliza espécies do gênero Eucalyptus principalmente em empresas atuantes na área de papel e celulose. No Brasil a área total com florestas plantadas em 2006, totalizou 5,74 milhões ha, sendo 3,55 milhões de ha com eucalipto; 1,82 milhão ha com pinus e 370,5 mil ha de outras espécies, apresentando um crescimento de pouco mais de 175 mil ha em relação ao ano de 2005 (5,56 milhões ha) (SBS, 2009). Minas Gerais apresenta como o maior em área de floresta plantada do país, ocupando 1,23 milhões ha, seguido por São Paulo com 963,3 mil ha, correspondendo a 21,5% e 16,8% respectivamente, da área plantada existente no Brasil (SBS, 2009). De acordo com a Abraf (2008), a capacidade de produção sustentável das florestas brasileiras é estimada em cerca de 390 milhões de m³/ano, dos quais 47,2% ou aproximadamente 183,6 milhões m³, são de florestas plantadas com pinus e eucalipto. O restante é ainda devido à exploração de florestas nativas. As alternativas para diminuir a pressão sobre recursos madeireiros de florestas nativas e produzir um aumento de produção de modo a atender a demanda segue-se duas alternativas: primeiramente o aumento da área produtiva atual, associada no aumento da produtividade nas áreas já ocupadas. Dentre as estratégias para se vencer este desafio destaca-se o melhoramento genético florestal.

2 Marcadores genéticos e Marcadores específicos (SSRs) A variabilidade genética é a base da biodiversidade e pode ser acessada por meio de marcadores genéticos. A associação de técnicas moleculares às técnicas tradicionais de melhoramento, propicia um grande avanço na obtenção de resultados. Assim os marcadores moleculares funcionam como ferramentas auxiliares no melhoramento genético florestal permitindo entre outros, avaliações da adequação da base genética de populações florestais para utilização em programas de melhoramento. Dentre os marcadores moleculares atualmente empregados, merecem destaque os microssatélites ou seqüências simples repetitivas (SSRs), por serem considerados ideais para estudos genéticos e de melhoramento uma vez que combinam vários aspectos de interesse: a co-dominância; multialelismo, o alto polimorfismo, a dispersão abundante e uniforme em genomas de plantas e a eficiente detecção por reação em cadeia da polimerase (PCR). Entretanto, para a execução de análises genéticas via PCR de microssatélites, se faz necessário o desenvolvimento de primers que possibilitem o reconhecimento dos loci de interesse e isto requer o conhecimento da seqüência de DNA flanqueadora a estes loci. Assim o desenvolvimento de primers específicos para cada espécie de eucaliptos envolve etapas laboratoriais morosas e de alto custo (ZUCCHI et al., 2003). Transferência de primers entre espécies e híbridos de Eucaliptos Existem primers desenhados para espécies mais utilizadas para produção de papel e celulose como é o caso do Eucalyptus grandis, em contrapartida existe espécies e híbridos do gênero Eucalyptus que não possuem sequências especificas desenhadas como é o caso Eucalyptus exerta, Eucalyptus saligna, Eucalyptus grandis x urophylla, e Eucalyptus grandis x camaldulensis. A transferabilidade de primers microssatélites reduz consideravelmente os custos e o tempo das investigações genéticas. Quando as espécies envolvidas na transferabilidade são proximamente relacionadas, têm-se maior chance de partilhar sítio de ligação de primers microssatélites do que em espécies menos próximas, mas é possível transferir primers funcionais mesmo entre espécies mais distantes (LORIEUX et al., 2000)

3 Objetivo do trabalho e experimento Diante de toda esta exposta versatilidade dos microssatélites o presente trabalho tem como objetivo verificar a transferabilidade de cinco pares de primers microssatélites heterólogos em Eucalyptus. Assim foram testados os primers EST-SSR (EUCA 30, 39, 50, 57 e 62) desenhados a partir do banco de dados do Consórcio FORESTs/FAPESP. (Tabela 1) Um total de 40 indivíduos pertencentes às espécies e híbridos de Eucalyptus (Eucalyptus exerta, Eucalyptus saligna, Eucalyptus grandis x urophylla, e Eucalyptus grandis x camaldulensis) uma coleção fornecida pela ESALQ e mantida na Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão (FEPE) da Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira foi submetido à extração de DNA conforme proposto por Ferreira e Grattapaglia, (1998) com pequenas modificações.(tabela 2) A reação de amplificação (PCR-SSR), de volume de 15 ul, foi constituída de tampão PCR (1X), 0,1mM de cada dntp, 2 mm de MgCl 2, 1uM de cada integrante do par de primer (F e R), 2 unidades de Taq DNA polimerase, 18 ng de DNA genômico. Para amplificação dos alelos utilizou-se programa do tipo touchdown universal. Os produtos de amplificação foram separados em géis de agarose 3%, em corrida com TBE (1X) com tensão constante de 110V. Tabela 1 - Características dos primers SSR-EST empregados na verificação de transferabilidade em Eucalyptus. Contig-EST Tamanho Temperatura Nome esperado do de melting Primer produto PCR ( C) (pb) Motif EGUTRT3110E03 Euca GAG (8) EGUTRT3344D11 Euca TC/GAG (12-6) EGUTSL1027G07 Euca CT (22) EGUTSL7212H07 Euca TCC (8) EGUTSL7216H10 Euca GCT (9)

4 Tabela 2 - Descrição das espécies e híbridos do gênero Eucalyptus, utilizados na extração de DNA. Espécie Procedência* Lote Número de indivíduos Eucalyptus exerta Itatinga SP IT Eucalyptus saligna Itatinga SP IT Eucalyptus grandis x urophylla Itirapina - SP IP10 10 Eucalyptus grandis x camaldulensis Anhembi - SP AN *Coleção fornecida pela ESALQ e mantida na Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão (FEPE) da Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira. Resultados e conclusão A partir dos perfis eletroforéticos obtidos foi possível verificar que diferentes níveis de transferabilidade foram obtidos.(figura 1) O primer EUCA 30 proporcionou a amplificação de alelos em 22 indivíduos, portanto com eficiência de 55%, entretanto nenhum deles era pertencente ao híbrido E. grandis X E. urophylla. O primer EUCA 39 permitiu amplificação em indivíduos de todas as espécies amostradas, com uma eficiência de 27,5%. Já os primers EUCA 50 e 57 tiveram eficiência de transferabilidade de 30 e 20% respectivamente, porém nenhuma amostra pertencente a E. saligna demonstrou amplificação. Finalmente a transferabilidade do primer EUCA 62 se deu com eficiência de 37,5%, com total ausência de bandas para as amostras de E. exerta. Embora os níveis de transferabilidade obtidos tenham sido de medianos a baixos, o emprego destes primers heterólogos é interessante, uma vez que cada um deles pode ser aplicado para uma ou algumas das espécies e híbridos estudados. Isto significa redução de custos e tempo na geração de marcadores moleculares para Eucalyptus.

5 Pb Figura 1 - Perfil eletroforético de amostras (canaletas 1 a 10) de Eucalyptus exerta amplificadas com o primer EUCA 30. (PM-padrão de tamanho molecular, CN- contole negativo). Referências bibliográficas ABRAF. Anuário Estatístico da ABRAF Associção Brasileira de produtores de florestas plantadas. Disponível em: < BR.pdf>. Acesso em: 20 jul FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3.ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN, p. LORIEUX, M.; NDJIONDJOP, M-N; GHESQUIÈRE, A. A first interespecific Oryza sativa & Oryza glaberrima microsatellite-based genetic linkage map. Theoretical and Applied Genetics, v. 100, p , SBS. Fatos e Números do Brasil Florestal. Sociedade Brasileira de Silvicultura. Disponível em: < Acesso em: 30 jul STAPE, J. L. Pesquisa busca maior retorno das áreas de reflorestamento. Disponível em: < Acesso em: 26 fevereiro 2007

6 ZUCCHI, M. I.; BRONDANI, R. P. V.; PINHEIRO, J. B.; CHAVES, L. J.; COELHO, A. S. G.; VENCOVSKY, R. Genetic strutures and gene flow in Eugenia dysenterica DC in the Brazilian Cerrado utilizing SSR markers. Genetics and Molecular Biology, v. 26, p , 2003.