EXTRAÇÃO DE DNA E ELETROFORESE

Transcrição

1 EXTRAÇÃO DE DNA E ELETROFORESE

2 Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos Obtenção do material: Vírus Bactérias; fungos Célula vegetal / célula animal

3 Extração de ácidos nucléicos a partir de sangue total

4 Extração de ácidos nucléicos a partir de sangue total

5 Extração de ácidos nucléicos Requerimento essencial: quantidade (rendimento) pureza integridade Etapas na obtenção de ácidos nucléicos: 1) Lise física ou bioquímica das paredes e celulares e membranas 2) Purificação dos ácidos nucléicos: desnaturação / inativação de proteínas celulares 3) Precipitação

6 Extração de ácidos nucléicos 1. Rompendo membranas celulares Lise das células liberação dos componentes citoplasmáticos e/ou nucleares Estratégia: de acordo com o tipo de célula envolvida (deve ser o mais gentil possível)

7 Extração de ácidos nucléicos Bactérias (parede glicoproteica) - tratamento inicial com lisozimas (orifícios na parede enfraquecimento rompimento em solução hipotônica); - outras soluções alternativas: temperatura elevada; sonificação. Células de plantas ou animais presentes em tecidos: Pré tratamentos adicionais para romper a matriz tecidual célula individual lise: digestão enzimática / homogeneização Célula vegetal parede celular: tratamento mecânico para promover lise.

8 Extração de ácidos nucléicos Células sem cobertura externa ou em solução: Sem tratamentos agressivos tratamento com detergente - SDS (dodecil sulfato de sódio) - substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucleicos e dissolvendo proteínas de membranas

9 Extração de ácidos nucléicos 2. Desnaturando proteínas celulares: - DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos. - Fragmentos de membrana lipídica. - Proteínas intracelulares: enzimas nucleases degradativas DNAses / RNAses interferem no rendimento dos ácidos nucléicos Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos: - Extração em baixas temperaturas - Incubação dos lisados com reagentes desnaturantes de proteínas - Agentes que retardam atividade das nucleases

10 Extração de ácidos nucléicos Agentes que retardam atividade das nucleases: - tampões de extração com agentes quelantes (EDTA ácido etileno diaminotetracético) - Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração - RNA- inibir Rnases (proteinase K; DEPC dietil pirocarbonato )

11 Extração de ácidos nucléicos 3. Separando DNA / RNA / Proteínas Extração por solventes - precipitação e/ou centrifugação Extração com fenol solvente orgânico; desnatura proteínas; permite isolamento de DNA e proteínas Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: 3 fases: aquosa (ácidos nucleicos) interface: proteínas camada do fenol

12 Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: Extração de DNA (fenol com ph neutro ou básico) 3 fases: aquosa (ácidos nucléicos: DNA e RNA) interface: proteínas camada do fenol Camada aquosa Camada de proteínas Camada do fenol p H ph neutro ou básico

13 p H ph ácido Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: Extração de RNA (fenol com ph ácido) 3 fases: aquosa (RNA) interface: proteínas camada do fenol (DNA) Camada aquosa Camada de proteínas Camada do fenol

14 Extração de ácidos nucléicos 4. Precipitação e lavagem com álcool DNA: Ressuspender DNA em TE ph 8,0 (Tris-HCl / EDTA), até completa dissolução Armazenar a 4ºC -20º C DNA precipitado

15 Gel de agarose 1% com 3 ml de DNA genômico M M - Marcador 1, 2 e 3 - amostras de DNA genômico

16 Extração de ácidos nucléicos Soluções utilizadas tampão de extração solução de lise solução desnaturante de proteínas fenol clorofórmio Etanol Proteinase K

17 Extração de ácidos nucleicos Função dos reagentes Tampão: proporciona um ph ideal para manutenção da integridade das moléculas de ácidos nucléicos; inibem atividade de desoxirribonuclease; ex.: TE - ph 8,0 (Tris-HCl / EDTA ácido etilenodiamino tetracético). Detergentes: substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucléicos e dissolvendo os lipídios de membrana; SDS = sodium dodecyl sulfate. Fenol: desnatura proteínas, permitindo o isolamento de DNA/RNA de amostras biológicas.

18 Extração de ácidos nucleicos Função dos reagentes Clorofórmio: desnatura proteínas aumentando a eficiência da extração de ácidos nucléicos. Inibidores de nucleases: quelante de Mg++(EDTA) DEPC dietil pirocarbonato). Etanol: induz alterações estruturais nas moléculas de ácidos nucléicos provocando a agregação das moléculas, seguida de precipitação (remove resíduos de fenol e clorofórmio). Proteinase K a contaminação com proteínas pode ser removida pela digestão com proteinase K

19 Conceito Eletroforese em gel: é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de um potencial elétrico. As moléculas são separadas de acordo com a sua carga elétrica e seu peso molecular, logo as de menor massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa. A eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.

20 Breve Histórico... Inicialmente proposta por Arne Teselius (1937). A eletroforese era técnica empregada para visualização de proteínas com suas diferenças de comprimento de fragmentos de aminoácidos e cargas elétricas. Atualmente, o uso desta técnica é comum também para estudos com ácidos nucléicos (Brown 1998; Farah 2000), na visualização de material genético (ácido desoxirribonucléico e ribonucléico, DNA e RNA). Arne Tiselus Prêmio Nobel de Química em 1948

21 Princípios da Eletroforese O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA, baseia-se na carga total negativa do DNA (dada pelos oxigênios do grupamento fosfato). Assim, fragmentos de DNA obtidos da técnica de PCR, podem ser separados pela aplicação de uma voltagem. Ao final do processo, as cadeias de DNA estarão próximas ao pólo positivo.

22 Princípios da Eletroforese 1.Separar partículas por diferença de carga e massa 2.Aplicaçao de corrente elétrica sobre o gel 3.Isolar fragmentos de DNA, RNA e proteínas

23 Cuba Eletroforética Fonte de eletricidade Suporte para o gel Pentes Pipetas Equipamentos

24 Equipamentos

25 Equipamentos

26 Gel de Agarose Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha. Não-tóxico. Fácil de preparar. Possuem ampla capacidade de separação,mas baixa resolução. Dependendo da concentração podem separar fragmentos de DNA de 200 a bp, via eletroforese. Custo elevado. Ao solidificar, após o aquecimento, os longos filamentos de agarose formam uma matriz (malha) que serve de "peneira" de separação de fragmentos de DNA.

27 Gel de Agarose Alguns fatores determinam a migração do DNA através do gel de agarose: a) tamanho da molécula de DNA b) concentração da agarose c) conformação do DNA (formas circulares ou lineares) d) a presença de brometo de etídio no gel e) voltagem aplicada f) tipo de agarose g) tipo do tampão de eletroforese

28 Soluções e Reagentes Tampão O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar e também para manter o ph mais ou menos constante. a) TAE (Tris-acetate-EDTA electrophoresis buffer Tampão de eletroforese-tris-acetato-edta) b) TPE (Tris-phosphate-EDTA lectrophoresis buffer Tampão de eletroforese-tris-fosfato-edta) c) TBE (Tris-borate-EDTA electrophoresis buffer Tampão de eletroforese-tris-borato-edta)

29 Soluções e Reagentes Tampão de carregamento (loading buffer) É uma solução composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol ) e glicerol, é misturado às amostras antes de carregar o gel e possui três finalidades: 1) aumentar a densidade da amostra 2) adicionar cor às amostras 3) simplificar o processo de carregamento

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31 Soluções e Reagentes Coloração do gel: 1) Brometo de etídio O brometo de etídio intercala-se com a molécula de DNA a cada 2,5 bp do fragmento, após sua inserção esse exerce uma ligação do tipo Van der Waals. A radiação UV é capaz de estimular essa ligação entre o DNA e o corante tornando a molécula ou banda visível no gel através de um dispositivo de transiluminação. Como o brometo de etídio se intercala no DNA, esta substância tem um poderoso efeito mutagênico e, possivelmente pode ser cancerígeno ou teratogênico.

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33 Marcadores de peso molecular Ạ distância que o fragmento percorre a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e eqüidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel no início do processo.

34 Montando a Eletroforese Preparação do Gel de Agarose 1. Para 100mL de gel, pesar 0,8g de agarose. 2. Adicionar 100mL de TAE 1X. 3. Fundir a solução no microondas até homogeneizar (sugestão: 2 a 2,5 min, potência 7). 4. Enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte de gel, selando as laterais com fita crepe ou na própria cuba. 5. Acrescentar 5μL de Brometo de Etídeo (10mg/mL) e misturar com agitação leve. 6. Despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas. 7. Colocar o pente da espessura desejada no suporte. 8. Esperar a solução solidificar. 9. Colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese.

35 Montando a Eletroforese Preparação das Amostras (DNA) 1. Extrair 3μL da amostra de DNA. 2. Homogenizar com 1μL de tampão de corrida 5X (Loading Buffer). 3. Aplicar as amostras nos poços. 4. Reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida (Ladder-1Kb).

36 Montando a Eletroforese Montar a Cuba Eletroforética Adicionar o gel, previamente preparada Adicionar tampão TAE 1X até cobrir a superfície do gel. Adiciona as amostras a serem separadas Ajustar a voltagem desejada(média 80v) e ligar a cuba

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38 Eletroforese em gel Eletroforese em gel de poliacrilamida: a poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T". Misturando essas duas moléculas, temos a formação de uma "rede".o gel de poliacrilamida tem maior capacidade de resolução e é mais efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp pares de base). Eletroforese Desnaturante: normalmente feita em gel de agarose, inclui um agente desnaturante (normalmente uréia), o que ajuda a tornar a separação melhor entre moléculas que apresentam diferenciação em suas estruturas secundárias.

39 Visualização após a Eletroforese. Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhando sob UV podemos ver as bandas de DNA.

40 Visualização após a Eletroforese.

41 Visualização após a Eletroforese.

42 Visualização após a Eletroforese.

43 . Visualização após a Eletroforese SYBR Green > Molecular Probes 1995 Revolucionou a detecção de DNA em géis. A intensidade da fluorescência do SYBR Green é aumentada em 100X quando se liga ao DNA. Consegue-se ver picogramas de DNA. Junto a sua sensibilidade superior o SYBR Green tem outras vantagens sobre o EtBr: - É muito menos mutagênico, - Pode ser adicionado diretamente à amostra antes da eletroforese.