PROTOCOLO DE UTILIZAÇAO

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1 PROTOCOLO DE UTILIZAÇAO Hibridação para cortes de tecidos preservados em parafina Materiais fornecidos: DNA marcado com moléculas fluorescentes (sonda). Buffer(tampão) de Hibridação Reativos para preparar solução de montagem (Antifade e DAPI) Sais para preparar 80ml de Buffer(tampão) de Desparafinado* Sais para preparar 80ml de Buffer(tampão) de Pré-tratamento* *ver protocolos de preparação abaixo. Materiais extras necessários: 2XSSC* Soluções de etanol 70, 90 y 100% Ácido clorídrico 0.2N Água destilada Pepsina 0.5%* Detergente não-iônico ph-metro ou papel para medir ph coverslip/lamínula Soluções de enxague (1 y 2)* Adesivo de contato removível Tubos 0,2 o 0,5ml Recipientes para enxagues (Coplin) Azeite de imersão Câmara úmida Termômetro *ver protocolos de preparação abaixo. Equipamentos requeridos: Microscópio de fluorescência: Nem sempre um microscópio utilizado em reações de imunoistoquímica ou outro tipo de análise com fluorescência resulta adequado. Os requerimentos para observar corretamente uma reação de FISH são os seguintes: o o o Fonte de Excitação: Recomenda-se uma lâmpada de mercúrio de 100 Watt com vida útil de 200horas. É necessário que uma vez colocada, a lâmpada seja alinhada corretamente. Objetivos: Para a localização do alvo (interfases ou metafases) se recomenda objetivas de 10, 20 y/o 40X. Para a análise da reação é necessário um objetiva de imersão especial para fluorescência com una apertura numérica 0,75. Filtros de excitação-emissão Cada fluorocromo observado precisará de diferentes filtros. Os requerimentos para nossas sondas podem ser vistas no quadro a continuação:

2 Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Verde Vermelho DAPI Micropipetas (1-10µl ou similar) Microcentrífuga Vórtex Timer Banho-maria Incubadora 37ºC) Placa termostática ou hibridizador Preparação de soluções extras: Buffer(tampão) de Deparafinado Adicionar as sais fornecidas no tubo rotulado Buffer de Desparafinado a 70ml de H2O ultra pura. Adicionar 400ul de detergente não iônico (NP40, Tween ou similar) Levar o ph a 8 com HCl. Completar até volume final (80ml) com H2O ultra pura. Depois de preparado manter na geladeira a 4ºC Buffer(tampão) de Pré tratamento: Adicionar as sais fornecidas no tubo rotulado Buffer de Pretratamento a 70ml de H2O ultra pura. Levar o ph 8.5 com HCl. Completar até volume final (80ml) com H2O ultra pura. Depois de preparado, manter na geladeira a 4ºC Pepsina Solução estoque: 10% [0.1g/ml] Diluir 0,1 g de pepsina em 1 ml de água ultrapura (Note-se a ph deve ser = 2) Após a preparação armazenar a -20 C Solução de trabalho: 0,05% [0.5mg/ml] Pepsina solução stock: 0,4 ml HCl 12N (puro): 0.66ml H2O destilada: 79ml (Observe o ph final deve ser = 2) Após a utilização, armazenar a 4 C durante 30 dias ou 4 utilizações. 2XSSC: Cloreto de Sódio (NaCl) 300mM Citrato de Sódio (Na 3 C 6 H 5 O 7 ) 30mM Ajustar o ph a 7 com Ácido clorídrico (HCl) 1N Depois de preparado, manter na geladeira a 4ºC Enxagues 1 e 2: Em um coplin adequado para 80ml, adicionar 80ml de 2XSSC e 0,080ml de detergente não-iônico. Depois de preparado, manter na geladeira a 4ºC

3 Precauções e advertências (Ler com atençao): Reagente analítico. Para uso em investigação somente. Este produto Não está provado para uso diagnóstico ou terapêutico. As reações como a interpretação das mesmas devem ser realizadas por pessoal idôneo devidamente treinado. Todas as amostras biológicas deveriam ser tratadas como possíveis transmissores de agentes infecciosos. Deve-se evitar a exposição da amostra a ácidos ou bases em alta concentração como também ao calor extremo. Estes fatores danificam o DNA e podem causar a falha da reação de FISH. Uma vez extraída a quantidade a ser utilizada, a sonda deve ser guardada novamente a -20ºC. A falha ou omissão de qualquer dos passos do protocolo detalhado abaixo pode gerar resultados errôneos ou inaceitáveis. As soluções de enxague pós-hibridação (ver protocolo) devem ser renovadas periodicamente devido a que são propensas de contaminação. O buffer de hibridação contém formamida, um teratógeno, por isso se deve evitar o contato com a pele e as mucosas. Recomenda-se o uso de luvas e avental de trabalho durante todo o processo. É necessário controlar sempre a temperatura das soluções que se utilizam quentes. Todos os materiais perigosos devem ser descartados de acordo com as normativas da sua instituição.

4 Protocolo de utilização Desparafinado: Passos prévios Preparar 1 recipientes (coplin) com Buffer (tampão) de Desparafinado. Pelo menos 30 minutos antes de começar o processo de desparafinado, em um banho termostático a 90ºC. (Opcional)Incubar as preparações contendo os cortes de tecido a 58ºC durante 30 minutos como mínimo. Mergulhar os vidros no Buffer de Desparafinado a 90ºC durante minutos. Enxaguar 2 vezes em Etanol 100% 3 minutos cada vez. Deixar secar Pré-tratamento: Passos prévios Preparar um recipiente (coplin) com Buffer de Pré-tratamento. Colocar em um banho termostático a 71ºC. Antes de utilizar conferir que a temperatura interna da solução seja de 71ºC (±1ºC) Preparar um recipiente (coplin) com Pepsina Solução de trabalho. Colocar em um banho termostático a 37ºC. Antes de utilizar conferir que a temperatura interna da solução seja de 37ºC (±1ºC) Mergulhar 20 minutos as preparações em HCl 0.2N a temperatura ambiente. Enxaguar em Água destilada 3 minutos 2 vezes. Mergulhar as preparações no Buffer(tampão) de Pré-tratamento a 71ºC durante 60 minutos. Mergulhar os vidros em 2 espaços sucessivos de 2XSSC, 5 minutos em cada um. Enxaguar em Água destilada brevemente. Mergulhar as preparações em Pepsina solução de trabalho a 37ºC durante 7 a 15 minutos. Enxaguar a pepsina mergulhando as preparações em 2 espaço sucessivos de H2O destilada, 3 minutos em cada um. Desidratar em Etanol 70, 90 e 100% 2 minutos em cada um. Deixar secar completamente. Co-desnaturalização: Preparação da sonda: Descongelar a sonda, homogeneizar em Vórtex Centrifugar rapidamente Descongele o buffer(tampão) hibridização Em um tubo de PCR adicionar: 7µl de Buffer de hibridação 1µl de sonda Homogeneizar em Vórtex Centrifugar rapidamente

5 Revelado Co-desnaturalização: Na parte de trás da lâmina marcar a região a hibridar (os 8µl preparados hibridam uma região aproximada de 22x22mm). Adicionar a solução de sonda sobre a região marcada Colocar um coverslip/lamínula de tamanho adequado Selar as bordas do coverslip/lamínula com adesivo de contato removível Colocar a lâmina montada sobre uma superfície quente (hibridizador, prancha termostática, etc.). Em ocasiões é conveniente colocar uma gota de água sobre a chapa aquecedora e depois colocar sobre esta a lâmina montada, desta forma se consegue uma película de água entre a lâmina e a superfície quente melhorando a transferência de temperatura. Esquentar a 71ºC durante 5-15 minutos. Colocar em câmara úmida, incubar a 37ºC toda a noite. Passos prévios Pelo menos 30 minutos antes, aquecer a solução de enxague 1 a 71ºC (±1ºC) conferindo com um termômetro calibrado a temperatura dentro do recipiente. Moderar a solução de enxague 2 a temperatura ambiente. Moderar a solução de contra-corante previamente preparada (ver protocolo em anexo) à temperatura ambiente. Enxague do excesso da sonda Extrair a lâmina da câmara úmida. Tirar cuidadosamente o adesivo de contato. Mergulhar a lâmina em uma solução de 2XSSC a temperatura ambiente até que o coverslip/lamínula se solte (2 a 5 minutos). Mergulhar a lâmina no enxague 1 durante 2 minutos exatamente. Mergulhar a lâmina no enxague 2 um mínimo de 1 minuto. Drenar o excesso de líquido. Desidratar em etanol 70, 90 e 100% 2 minutos cada um. Esperar que seque completamente. Colocar sobre a região hibridada uma gota (aprox. 10µl) de contra colorante. Adicionar um coverslip/lamínula de um tamanho maior que a região hibridada. Drenar o excesso de contra colorante pressionando suave e uniformemente com papel absorvente. Eliminar possíveis bolhas de ar pressionando suavemente com a ponta de um clips. A reação está pronta para ser analisada.

6 Protocolo Resumido: Passo Tempo Desparafinado (Opcional)Incubação a 58ºC Mínimo 30 Buffer(tampão) Desparafinado 90º Etanol 100% x2 3 Deixar secar /// Pré-tratamento HCl 0.2N 20 H2O x2 3 Buffer(tampão) Pré-tratamento 71ºC 30 2xSSC x2 5 H2O brevemente /// Pepsina 37ºC 7-15 H2O X2 3 Etanol 70, 90, 100% 2 Deixar secar /// Co-desnaturalização-Hibridação Co-desnat 71ºC 8-15 Hibridação 37ºC Aprox. 18hs Revelado Enxague 1 71ºC 2 Enxague 2 Tº Amb Mínimo 1 Etanol 70, 90, 100% 1 Deixar secar /// Montado com Sn. Montagem ///