PROTOCOLO PADRÃO DE TÉCNICAS PARA SECÇÕES EM CRIOSTATO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB LABORATÓRIO MULTIUSUÁRIO DE ESTUDOS EM BIOLOGIA PROTOCOLO PADRÃO DE TÉCNICAS PARA SECÇÕES EM CRIOSTATO REVISADO EM 26/07/2017 RECOMENDAÇÕES Antes do uso do Criostato, recomendamos a fixação prévia do material, no entanto, o usuário poderá seguir o protocolo mais conveniente ao seu tipo de análise; Para evitar a formação de cristais de gelo no interior dos tecidos durante o uso do criostato, é recomendado a utilização prévia de soluções crioprotetoras, como a sacarose 30%; Para a correta aderência das secções histológicas nas lâminas de vidro, é importante a utilização de substâncias adesivantes, como a gelatina, o silano ou a polilisina. Seguem abaixo os protocolos mais utilizados nas técnicas com criostato: 01) DISSECAÇÃO Se o órgão for muito grande, deve-se fazer a macrotomia deste antes, mas isto vai depender do tipo de análise a ser realizada. 02) FIXAÇÃO Esta etapa consiste na utilização de substâncias que interrompam o metabolismo celular, estabilizando as estruturas e os componentes bioquímicos intra e extracelulares, mantendo assim a arquitetura normal do tecido. Além disso, os fixadores também fornecem maior resistência ao tecido para suportar as demais etapas; Dependendo do tipo de análise, deve-se optar por um fixador específico, por exemplo, para análise em microscopia de fluorescência, é muito utilizado o paraformaldeído tamponado. Neste caso não se deve utilizar o glutaraldeído, pois este gera autofluorescência. Para microscopia de luz branca, o glutaraldeído é um ótimo fixador, mas pode ser utilizado também o paraformaldeído. A formalina neutra tamponada também é utilizada para microscopia de luz branca, mas para uma análise histológica mais geral, não é indicada para análises mais detalhadas; O volume do fixador deve ser em torno de 20x o volume das amostras.

2 FIXADORES: PARAFORMALDEÍDO 4% TAMPONADO PH 7,2: PFA (Paraformaldeído) g Água destilada ml PBS 0,2M ml Hidróxido de Sódio... 2 pedrinhas ou 3 gotas (1N) Preparo: Aquecer a água destilada até 70 C, no misturador, colocar o imã (bailarina) e liga-lo, acrescentando aos poucos o PFA; Jogar duas pedrinhas ou mais de hidróxido de sódio ou de 3 a 5 gotas de hidróxido de sódio 1N até a mistura ficar clara e homogênea (transparente); Por último, acrescentar a solução de PB 0,2M; Medir o ph (ph ~ 7,2) e filtrar a solução. Observações: O material deve permanecer no fixador de 12-24h; Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, ph 7,2 (30 minutos) e em seguida em H 2 O destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação. FORMALINA NEUTRA TAMPONADA PH 7,2: Observações: Formol 37% ml Água destilada ml Fosfato de Sódio Monobásico (1H 2 O)... 4,0 gramas Fosfato de Sódio Dibásico (7H 2 O)... 12,2 gramas Formol 37% ml Água destilada ml Fosfato de Sódio Monobásico (Anidro)... 4,0 gramas Fosfato de Sódio Dibásico (Anidro)... 6,5 gramas O material deve permanecer no fixador por aproximadamente 24h; Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, ph 7,2 (30 minutos) e em seguida em H 2 O destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação. ou

3 GLUTARALDEÍDO 2,5% TAMPONADO PH 7,2: Glutaraldeído 25%... 5mL Tampão Fosfato de Sódio 0,1M... 45mL Observações: O material deve permanecer no fixador de 4-24h; O Glutaraldeído não deve ser usado para testes de imunofluorescência; Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, ph 7,2 (30 minutos) e em seguida em H 2 O destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação. Solução Tampão Fosfato de Sódio (PBS - 0,2M) Água destilada... 1 L Fosfato de Sódio dibásico anidro... 11g Fosfato de Sódio monobásico monohidratado...2,75g Solução Tampão Fosfato de Sódio (PBS - 0,1M) Água destilada... 1 L Tampão PBS 0,2M... 1 L 03) PROCESSAMENTO COM SACAROSE Esta etapa consiste na retirada do fixador por substituição da sacarose, uma solução crioprotetora. Fazer as soluções de sacarose no momento do uso (máximo 1/2 dia); Dependendo do tecido é importante fazer mais diluições (10%, 20% e 30%). Reagentes: Solução de sacarose 10% Tampão utilizado na fixação ml Sacarose... 10g

4 Solução de sacarose 20% Tampão utilizado na fixação ml Sacarose... 20g Solução de sacarose 30% Tampão utilizado na fixação ml Sacarose... 30g Procedimento: Deixar de 1 a 2 horas na solução de 10 e 20% e no mínimo 4 horas na solução de 30% (esta pode ficar por até 48hs); Após 2 horas na sacarose 30% deve-se conservar o material em geladeira; Levar o material para ser seccionado no Criostato mergulhado na sacarose 30% ou se preferir, pode levá-lo já congelado ou emblocado com o meio de montagem para espécimes em congelamento. Importante: Caso o material esteja no fixador, antes de colocar nos banhos de sacarose deve-se primeiramente lavar o material em tampão (no mesmo tampão do fixador) por aproximadamente 30 minutos. O tampão da sacarose também deve ser o mesmo utilizado no fixador. Se o material já estiver em álcool 70%, recomendamos hidrata-lo antes de proceder com os banhos de sacarose realizando o seguinte procedimento: de 30min a 1 hora no álcool 50%; de 30min a 1 hora no álcool 30%, de 30min a 1 hora em água destilada ou tampão (o mesmo da sacarose). Em seguida proceder com os banhos de sacarose descritos acima.

5 04) ENDURECIMENTO DO MATERIAL Esta etapa consiste no endurecimento do tecido através da técnica de congelamento, permitindo assim, a realização de secções finas (5 a 50 micrômetros); O congelamento das amostras pode ser realizado diretamente na câmera criostática, na temperatura de - 15ºC à -30ºC. A temperatura de congelamento vai depender do tipo de amostra, por exemplo, amostras com maior teor de água requerem temperaturas mais altas e com maior teor de gordura temperaturas mais baixas; As amostras poderão ser previamente congeladas em freezers antes do uso do criostato. Neste caso, recomenda-se a ambientação das amostras na câmara criostática por no mínimo 1 hora; Amostras muito pequenas poderão ser emblocadas com o uso de meio de montagem para espécimes em congelamento. Este emblocamento pode ocorrer utilizando a câmara criostática ou freezer. A temperatura de congelamento do bloco vai depender do tipo de amostra. 05) ADERÊNCIA DAS SECÇÕES HISTOLÓGICAS NAS LÂMINAS HISTOLÓGICAS Para melhor aderência das secções histológicas nas lâminas de vidro, é importante a utilização de substâncias adesivantes nessas, como a gelatina, o silano ou a polilisina. GELATINIZAÇÃO DAS LÂMINAS: Solução de revestimento: Preparo: Água destilada ml Sulfato de Cromo e Potássio... 0,48 g (ou 5 gotas de toluol ou fenol) *Estes reagentes são antifúngicos Gelatina incolor e sem sabor... 3,75g Aquecer a água destilada até 70 C, e então colocar a gelatina sob agitação, Tomar cuidado para não empelotar a gelatina; Quando a solução estiver homogeneizada coloque o antifúngico; Filtrar a solução. Fazer a solução de gelatinização no momento do uso (máximo 1/2 dia).

6 Procedimento: Mergulhar as lâminas em água destilada e depois mergulhar na solução de gelatina. Tomar cuidado com as bolhas; Escorrer e deixar secar em estufa (45ºC) na posição vertical, no suporte de lâminas; Mergulhar novamente na solução de gelatina; Escorrer e deixar secar novamente em estufa (45ºC) na posição vertical, no suporte de lâminas. Quando as lâminas estiverem bem secas, estas podem ser guardadas a temperatura ambiente por um longo período de tempo. Importante: Caso não seja utilizado o antifúngico, guardar as lâminas por no máximo 2 semanas a temperatura ambiente; Para análise de imunofluorescência não recomendamos o uso da gelatina. SILANIZAÇÃO DE LÂMINAS - PARA IMUNOHISTOQUÍMICA Solução de revestimento: Silano ml Acetona ml Procedimento: Mergulhar as lâminas na solução de silano 2,5% (5 min); Mergulhar em água Destilada (2 min); Escorrer e deixar secar a temperatura ambiente na posição vertical, no suporte de lâminas. Não utilizar luvas com talco. POLINIZAÇÃO DE LÂMINAS - PARA IMUNOHISTOQUÍMICA Solução de revestimento: poli-l-lisina 0,01% Procedimento: Mergulhar as lâminas na solução de poli-l-lisina 0,01% por 30 min; Escorrer e deixar secar em estufa (40ºC) na posição vertical, no suporte de lâminas. Não utilizar luvas com talco.