Preparação do gel de poliacrilamida

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1 Preparação do gel de poliacrilamida Materiais: - álcool 70% (limpeza) - SDS 10% - água Milli-Q - APS 10% - acrilamida/ bisacrilamida 40% - TEMED - tampão Tris-HCl, ph 8,8 e 6,8 - vidros 1º Limpar os vidros com álcool 70% 2º Montar os vidros no suporte de montagem da seguinte forma: - suporte de montagem - pentes Esquema 1: montagem dos vidros 3º Preparar os géis de separação (baixo) de acordo com a % desejada de acrilamida (ver tabela abaixo) e o de empilhamento (cima) sem adicionar o APS e o TEMED. Sempre pipetar na seguinte ordem: água; tampão (baixo = ph 8.8; cima = ph 6.8); acrilamida; SDS. gel de separação gel de empilhamento água q.s.p. 25mL 8mL tampão respectivo 6,25mL 3,1mL acrilamida/ bisacrilamida 2,5.(x) = 25mL 1,25mL SDS 200µL 125µL TEMED 12,5µL 12,5µL APS 125µL 120µL OBS.: O volume total do gel de separação é de 25mL, x é a concentração do gel que se deseja e os volumes da tabela servem para cerca de 5 géis de 1mm. 4º Adicionar o APS e TEMED à preparação do gel de baixo, misturar a preparação e colocar 4,5mL para cada gel. 5º Adicionar um pouco de butanol para evitar o contato da preparação com o ar enquanto o gel polimeriza, evitando a evaporação. 6º Depois de polimerizado o gel de separação, jogar fora o butanol e lavar com água até remover todo o butanol. 7º Adicionar APS e TEMED à preparação do gel de cima, misturar e colocar volume suficiente para encher todo o vidro. 8º Colocar o pente de forma a evitar a formação de bolhas.

2 Esquema 2: Colocação do pente OBS.: Se o gel não for utilizado na hora pode ser armazenado em geladeira em papel embebido com água, embrulhado em PVC (papel filme), selado com parafilme e fita craft (não esquecer de identificar a concentração do gel) ou imerso no tampão de corrida. Incubação com os anticorpos 1º Após o tempo de bloqueio, remover a solução e guardar para posterior reutilização; 2º Incubar com o anticorpo primário nas condições padronizadas para cada anticorpo; 3º Proceder a 3 lavagens de 10 minutos com tampão-tween 0,1% sob agitação; 4º Incubar com o anticorpo secundário nas condições padronizadas para cada anticorpo; 5º Após o tempo de incubação com o secundário, proceder novamente com mais 3 lavagens de 10 minutos com tampão-tween 0,1% sob agitação. (As lavagens têm a finalidade de remover todo o primário que não foi especificamente ligado.) OBS.: Cada anticorpo tem uma diluição própria e tempo de incubação que deve passar por padronização prévia. No caso de anticorpo primário a diluição provavelmente dependerá do tipo de membrana utilizada, geralmente a de PVDF é mais eficiente, logo a diluição nesta é maior do que na de nitrocelulose por exemplo. Para o anticorpo secundário, geralmente a diluição é indicada pelo fabricante, mas pode ser aprimorada de acordo com o objetivo. O importante na escolha do secundário é verificar em que hospedeiro foi preparado o anticorpo primário (camundongo, coelho, cabra...).

3 Montagem do cassete de corrida 1º Manusear o equipamento com cuidado. No caso de serem 2 géis, colocar um de cada lado com o vidro menor voltado para dentro, como na figura abaixo, encaixando a parte inferior de forma inclinada para entrar e encaixar o gel de baixo imediatamente embaixo da borrachinha verde do cassete. No caso de ser 1 gel, colocar o suporte plástico do outro lado; 2º Encaixar os dois géis ao mesmo tempo e fechar as duas alavancas verdes simultaneamente; 3º Encaixar o cassete na cuba (atenção para os lados dos eletrodos); 4º Encher dentro do cassete de tampão de corrida 1x e se certificar de não estar vazando; 5º Aplicar as amostras (na ordem desejada com o vidro maior voltado para você); 6º Colocar tampão de corrida na cuba até a demarcação desejada (para 2 ou 4 géis); 7º Encaixar a tampa (atenção para os lados dos eletrodos) e aplicar a corrente (para cada 1 gel 15 ma até sair do gel de cima e 25mA até o final) OBS: Em caso de mais de um gel, anotar na cuba a posição de cada para saber qual é qual. Esquema 1: Montagem do cassete

4 Bloqueio 1º Retirar a membrana da transferência removendo os papelões com cuidado para não desfazer o pareamento gel-membrana (antes observe se a transferência funcionou, ou seja, se o marcador está também na membrana); 2º Colocar na palma da mão o lado que está em contato com a membrana, remover o papel de cima e, com o gel à mostra, cortar o excesso de membrana em torno do gel; 3º Removido o gel temos que a face superior é a frente da membrana, logo, fazer um pequeno corte na face superior direita da membrana para sabermos qual o lado de cima da mesma (o que recebeu as proteínas); 4º Descartar o gel e marcar as bandas do marcador com caneta (fazer uma cruz nas vermelhas) nas duas extremidades. 5º Anotar o nome da membrana e a data antes de embeber a membrana na solução de bloqueio e incubar sob condições padronizadas para cada anticorpo. OBS.: Para proteínas de membrana incubar a membrana recém transferida em tampão pré-bloqueio. Objetivo: Aumentar a especificidade do anticorpo Uma vez que a membrana tem propriedade de se ligar à proteínas, ao embebê-la com proteínas provenientes da solução de bloqueio, impedimos a ligação não específica do anticorpo. Assim como qualquer outra incubação daqui para frente, se houver 2 membranas, nunca colocar uma de frente para outra. O objetivo disto é garantir que o lado da membrana que recebeu as proteínas do gel na transferência entre em contato com as soluções e também para evitar que o atrito prejudique a ligação das proteínas do bloqueio ou dos anticorpos na membrana. Existem diferentes tipos de boqueio: leite 5% (armazenado em freezer); BSA 5% (armazenado em freezer); ou bloqueio vegetal (armazenado em geladeira) e a escolha vai depender de padronização prévia. O importante é sempre anotar as condições de incubação, tempo e data das soluções e como essas foram preparadas, quais regentes foram usados, para melhor reprodutibilidade do ensaio.

5 Montagem da transferência 1º Cortar a membrana e embeber em tampão de transferência 2º Umedecer o aparelho de transferência semi-seco com o mesmo tampão, assim como os papelões; 3º Desmontar o cassete de corrida e remover o gel separando os 2 vidros com a ajuda da espátula verde; 4º Começar a montar o sanduiche, lembrando que a parte de baixo do aparelho é o lado negativo. Colocar primeiro um papelão; 5º O próximo componente do sanduiche é o gel. Neste ponto temos que tomar cuidado com a posição do gel, se ao separar os vidros ele ficou no vidro maior colocar na mesma posição; *OBS.: lembrar como foi aplicado o gel e que a transferência das amostras do gel para a membrana é de forma espelhada 6º Em cima do gel colocar a membrana; 7º Terminar de montar o sanduiche colocando mais um papelão; 8º Fechar o aparelho e programá-lo para tempo e corrente adequada. **OBS.: Em caso de mais de um gel colocar estes separados na área do aparelho e manter o programa de costume, uma vez que é a área do gel que é considerada para que ocorra transferência com os parâmetros setados.