TÉCNICA TESTE PARA IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES *4

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1 CENTRO REGIONAL DE HEMOTERAPIA DO HCFMRP - USP TÉCNICA TESTE PARA IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES *4 TEIH REV.: 04 P.: 01/06 1. Objetivo Consiste em colocar o soro a ser testado em contato com hemácias com antígenos conhecidos (préfenotipadas) para a identificação do(s) anticorpo(s) aí presente(s). 2. Amostra Soro. 3. Reagentes Hemácias comerciais pré-fenotipadas (Painel de hemácias) Hemácias controle comercial recobertas com IgG Antiglobulina Humana Solução Salina 0,9% Albumina bovina 22% Solução de LISS (Red ion) Solução de baixa força iônica modificada (LO-ION) *1 PEG *2 Antiglobulina Humana anti-igg *2 4. Equipamentos / Materiais Centrífuga Sorológica Banho-Maria 37ºC (calor úmido) Aglutinoscópio ou leitura contra luz branca Tubos de Vidro (10 x 75mm ou 12 x 75mm) Pipeta (pipeta tipo Pasteur - plástica - 50µl = 1 gota) Estante Canetas para identificação da amostra Geladeira (armazenamento de reagentes) 5.-Técnica *2 EM MEIO SALINO - Identificar tubos de ensaio limpos de acordo com o número de hemácias do painel utilizado, e dispensar 1 gota da suspensão de hemácias de cada frasco nos tubos correspondentes. - A cada um dos tubos colocar 2 gotas do soro a ser testado. Misturar. - Incubar a temperatura ambiente (18 a 22ºC) durante 10 a 20 minutos.centrifugar de acordo com

2 TITIPA TESTE PARA IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES *4 P.: 02/06 - Incubar os tubos em banho-maria 37ºC durante 30 a 60 minutos. Centrifugar conforme validação da centrífuga e ler. - As misturas hemácias/soro devem ser bem lavadas com solução salina 0,9% no mínimo 3 vezes. Decantar todo o sobrenadante da última lavagem. - Adicionar 1 a 2 gotas de Antiglobulina Humana (de acordo com recomendação do fabricante). Misturar bem. - Centrifugar de acordo com EM MEIO ALBUMINOSO (Albumina bovina 22%) - Identificar tubos de ensaio, limpos de acordo com o número de hemácias do painel utilizado, e dispensar 1 gota da suspensão de hemácias de cada frasco nos tubos correspondentes. - A cada um dos tubos colocar 2 gotas do soro a ser testado.misturar. - Incubar a temperatura ambiente (18 a 22ºC) durante 10 a 20 minutos. - Centrifugar de acordo com validação da centrífuga e ler - Adicionar aos tubos albumina bovina 22% (de acordo com recomendação do fabricante) e misturar. Centrifugar e ler. - Incubar ambos os tubos em banho-maria 37ºC durante 15 a 30 minutos. Centrifugar de acordo com a - As misturas das hemácias/soro devem ser lavadas com solução salina 0,9% no mínimo 3 vezes. Decantar todo o sobrenadante da última lavagem. - Adicionar 1 a 2 gotas de Antiglobulina Humana (de acordo com recomendação do fabricante). Misturar e centrifugar de acordo com EM MEIO TRATADO COM SOLUÇÃO DE LISS - Identificar tubos de ensaio limpos de acordo com o número de hemácias do painel utilizado, e dispensar 1 gota da suspensão de hemácias de cada frasco nos tubos correspondentes. - As hemácias devem ser previamente tratadas com solução de Liss da seguinte maneira (para teste individual). - Lavar 2 vezes com solução salina 0,9% e decantar todo o sobrenadante. - Lavar 1 vez com solução de Liss, decantar todo o sobrenadante e prosseguir técnica. - A cada um dos tubos colocar 2 gotas do soro a ser testado e misturar. - Incubar a temperatura ambiente (18 a 22ºC) durante 10 a 15 minutos. Centrifugar de acordo com - Incubar ambos os tubos em banho-maria 37ºC durante 10 a 15 minutos. Centrifugar de acordo com a - As misturas hemácias/soro devem ser lavadas com solução salina 0,9% no mínimo 3 vezes. Decantar todo o sobrenadante da última lavagem. - Adicionar 1 a 2 gotas de Antiglobulina Humana (de acordo com recomendação do fabricante). Misturar bem, centrifugar e ler. EM MEIO TRATADO COM SOLUÇÃO DE BAIXA FORÇA IÔNICA MODIFICADA (LO-ION) - Identificar tubos de ensaio limpos de acordo com o número de hemácias do painel utilizado, e dispensar 1 gota da suspensão de hemácias de cada frasco nos tubos correspondentes. - A cada um dos tubos colocar duas gotas do soro a ser testado. - Adicionar duas gotas do LO-ION e agite bem. Se desejado, a adição do LO-ION poderá ser postergado até imediatamente antes da fase de incubação a 37ºC.

3 CENTRO REGIONAL DE HEMOTERAPIA DO HCFMRP - USP TÉCNICA TESTE PARA IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES *4 TEIH REV.: 04 P.: 03/06 - Misturar bem e centrifugar segundo validação da centrífuga. - Examinar para hemólise e anotar os resultados. - Ressuspender as hemácias através de delicada agitação. - Nota: O botão deve ser completamente ressuspenço antes da leitura para aglutinação. - Ler macroscopicamente para aglutinação e anotar os resultados. - Incubar os testes por pelo menos 10 minutos a 37ºC, e repetir as leituras para hemólise a aglutinação (o tempo de incubação pode ser aumentado para 30 minutos, se desejado). - Lavar as hemácias por pelo menos três vezes enchendo o tubo (a 1cm da borda) com solução fisiológica 0,9%, tendo o cuidado de decantar a salina entre as lavagens e ressuspender as células vigorosamente quando adicionar a salina para lavagem seguinte. - Decantar a salina completamente após a última lavagem. - Adicionar de uma a duas gotas de Antiglobulina Humana para o botão seco de células (conforme instruções do fabricante). - Misturar bem e centrifugar. - Ressuspender as hemácias através de delicada agitação. - Ler macroscopicamente para aglutinação e anotar os resultados. EM PEG - Identificar tubos de ensaio limpos de acordo com o número de hemácias do painel utilizado, e dispensar 1 gota da suspensão de hemácias de cada frasco nos tubos correspondentes. - Adicionar então, 2 gotas de soro teste aos tubos. - Centrifugar durante 15 a 30 segundos, de acordo com validação da centrífuga. - Realizar a leitura e anotar o resultado. - Adicionar 4 gotas de PEG - Incubar em banho-maria 37ºC por 15 minutos, - Lavar 4 vezes o conteúdo dos tubos com salina, decantando e secando bem a borda destes na última lavada. - Adicionar 1 gota de Antiglobulina Humana Monoespecífica anti-igg. - Misturar e centrifugar de acordo com a validação da centrífuga. - Realizar leitura, anotar e interpretar o resultado. Observação: Adicionar 1 gota de hemácias controle de Coombs (hemácias recobertas com IgG) aos tubos onde se observou reação negativa. Centrifugar de acordo com a validação da centrífuga. Realizar leitura. O resultado deverá ser positivo. Esta etapa permite avaliar: Se as hemácias utilizadas no teste foram corretamente lavadas, caso contrário, haverá neutralização dos anticorpos do reagente Antiglobulina Humana pelas globulinas residuais presentes no soro teste, que não foram totalmente retiradas com a lavagem da hemácias, apresentando resultado falsonegativo, devendo-se assim repetir a pesquisa. Se o soro Antiglobulina Humana que está sendo utilizado está em boas condições. Repetir a pesquisa caso não se observe aglutinação, utilizando um frasco novo de Antiglobulina.

4 TITIPA TESTE PARA IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES *4 P.: 04/06 6.-Critérios de Avaliação Ausência de aglutinação em todas as etapas do teste, indica ausência de anticorpos irregulares contra antígenos presentes nas hemácias de triagem do painel utilizado. A presença de aglutinação em qualquer uma das fases deve ser investigado o tipo de anticorpo. Quando não se identificar nenhum anticorpo específico, tentar investigação pôr outros métodos (conforme fluxogramas). *3 As unidades que não dispuserem de todas as técnicas para a identificação de anticorpos deverão testar as amostras com PAI positivo pela técnica que estiver disponível. Caso o anticorpo não seja identificado, a amostra deverá ser encaminhada para identificação no Hemocentro. *4 Aprovação Supervisor do Laboratório de Imuno-Hematologia Data / / *2 Diretor Responsável Data / / Implementação Garantia da Qualidade Data / /

5 CENTRO REGIONAL DE HEMOTERAPIA DO HCFMRP - USP TÉCNICA TESTE PARA IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES *4 TEIH REV.: 04 P.: 05/06 Fluxograma IAI Doadores *3 Painel e autocontrole a frio e em PEG PEG + a frio +** PEG + a frio - PEG - a frio +** Acs identificandos (a frio e a quente) Se Ac a quente não identificado, Realizar painel pré-aquecido Em PEG Se Ac não identificado, Realizar painel Em LISS Ac frio apenas Se Ac a quente não identificado, Realizar painel pré-aquecido Em LISS Se Ac não identificado, Realizar painel em enzima Se Ac a quente não identificado, Realizar painel pré-aquecido Em enzima Se Ac não identificado, realizar Técnicas adicionais Se Ac não identificado, realizar Técnicas adicionais Conforme orientação Do responsável, caso necessário ** Não há necessidade de se determinar a especificidade de anticorpos frios. Obs: Sempre realizar em paralelo autocontrole (fase fria, PEG, LISS, enzima, préaquecido) Se autocontrole positivo, a realização do eluato será discutida caso a caso pelo responsável.

6 TITIPA TESTE PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES *4 P.: 06/06 Fluxograma IAI Pacientes *3 Obs: Sempre realizar em paralelo autocontrole (fase fria, PEG, LISS, enzima, pré-aquecido) Se autocontrole positivo, a realização do eluato será discutida caso a caso pelo responsável. Se tratar-se de IAI de paciente com diagnóstico ou suspeita de AHAI por anticorpo de baixa avidez (TAD+ apenas após lavagem da solução de hemácias a 4 o C), realizar painel utilizando-se lavagem de com salina a 4 o C e LISS a 4 o C. Se AHAI, realizar a compatibilização com o soro adsorvido (autoadsorvido ou soros aloadsorvidos).