Universidade Federal de Pelotas Medicina Veterinária Zoonoses. Diagnóstico laboratorial Brucelose TESTE DO ANEL DO LEITE (TAL)

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1 Universidade Federal de Pelotas Medicina Veterinária Zoonoses Diagnóstico laboratorial Brucelose TESTE DO ANEL DO LEITE (TAL)

2 Diagnóstico a campo de Brucelose Med. Veterinário (privado) HABILITADO Curso de treinamento reconhecido pelo MAPA Padronizar diagnóstico ações sanitárias eficácia de um programa sanitário

3 Testes oficiais (PNCEBT) - Brucelose Triagem (MV habilitado, laboratório credenciado, laboratório oficial credenciado) Teste do anel do leite Teste do antígeno acidificado tamponado Confirmatórios: (reagentes aos de triagem) Teste do 2-mercaptoetanol (laboratório credenciado, laboratório oficial credenciado) Teste de fixação do complemento (laboratório oficial credenciado)

4 Teste do Anel do Leite (TAL) Monitorar condição sanitária de propriedades livres (rebanhos livres) Identifica rebanho leiteiro (vacas em lactação) com o problema outro diagnóstico para comprovar quais vacas em lactação são infectadas

5 Teste do Anel do Leite (TAL) Leite: anticorpos contra Brucella abortus Teste sorológicos - Diagnóstico INDIRETO (pesquisa de anticorpos) Teste de aglutinação Antígeno usado no teste: células inteiras de B. abortus

6 Teste do Anel do Leite (TAL) Triagem: alta sensibilidade Capacidade do teste em fornecer resultado positivo quando a animal é infectado Sensível: detectar 1 animal positivo entre 150 animais testados (leite)

7 Teste do Anel do Leite Leite de mistura rebanho em lactação Amostra de leite: representativa - todas vacas lactação Tarro Tanque de refrigeração Caminhão tanque / isotérmico Detecta rebanho infectado Não individualmente o animal infectado Evita manejo direto com animal Prejudica a ordenha / estresse = queda produção

8 Teste do Anel do Leite (TAL) Antígeno corado com hematoxilina positivo Cor azul característica reação positiva Anel de creme Coluna de leite

9 Teste do Anel do Leite (TAL) Anticorpos Anti B. abortus Antígeno células de B. abortus + corante hamatoxilina Aglutinação Malha de complexo Ag - Ac Arrastada para superfície pelos glóbulos de gordura (menos denso) Anel azulado no creme Reação positiva

10 Teste do Anel do Leite (TAL) Ausência de anticorpos anti-b. abortus Antígeno células de B. abortus + corante hamatoxilina Ausência de aglutinação Gordura do creme: anel de creme: branca Corante na coluna de leite- azulada Reação negativa

11 Teste do Anel do Leite (TAL) Limitações: resultados FALSO-POSITIVOS Leite ácido Animais com mastite Início de lactação colostro Secagem INSTABILIDADE interferir no resultado

12 Colheita de amostra de leite CRU Correta resultados confiáveis Mistura de leite representar o leite ordenhado de todas as vacas em lactação Misturar o leite suavemente: homogêneo / creme não estar separado Usar uma colher tarro Ligar o misturador do tanque

13 Colheita de amostra de leite CRU Tamanho do rebanho x quantidade de leite usada na hora do exame (no tubo de vidro) Até 150 vacas lactação: 1 ml leite 151 até 450 : 2 ml 451 até 700 : 3 ml acima de 700 : dividir em lotes menores Quantidade antígeno sempre a mesma (30 µl = 0,03 ml)

14 Colheita de amostra de leite Frasco: limpo, esterilizado, tampa (100 ml / tarro, tanque) Conservante: evitar proliferação de microrganismos (cru): proteólise = interferir na reação Ag-Ac Formol 1% ou Cloreto de mercúrio 2% 1 ml de conservante 10 ml leite

15 Colheita de amostra de leite Refrigerar o frasco com a amostra Armazenar a 2ºC a 8ºC por até 2 semanas Enviar para o laboratório Sala no laboratório: T.A. controlada 22ºC ± 4ºC (ar condicionado) Evitar luz solar

16 Interferências Amostra mal homogeneizada excesso ou falta de gordura (formação do anel de creme) Agitação excessiva (quebrar a gordura) Aquecimento excessivo (> 45ºC / 5 min - destruição dos anticorpos) Excessivo tempo e temp. de armazenamento (4ºC até 2 semanas pode usar)

17 Interferências FALSO-POSITIVO Leite fresco teste realizado no mesmo dia da colheita (instável) Refrigeração por 24 hs resolve esse problema (tempo para estabilizar o leite) Mastite: proteínas, células e bactérias

18 Interferências FALSO-NEGATIVOS Congelamento (quebra dos glóbulos gordura) Pasteurização (queda no título de anticorpos) Não utilizar leite pasteurizado ou congelado para o teste!

19 Material para o teste Amostra de leite Homogeneização correta do leite de mistura Conservante 1 ml para 10 ml leite 2ºC a 8ºC por mín. 24 hs sob refrigeração antes do teste

20 Material para o teste Antígeno para TAL Células B. abortus + hematoxilina (corante azul) Compra: habilitado / controlado pela MAPA / adquirido no serviço de DSA Estadual Conservados sob refrigeração (2 C a 8 C) Usados sempre dentro do prazo de validade Não podem ser congelados

21 Material para o teste Luvas látex Tubos de vidro: 1 cm x 7,5 cm ou 1 cm x 10 cm Grade para tubos Pipetas de 1 ml Micropipetador calibrado 30 µl Estufa ou banho-maria a 37ºC

22 Material para o teste Testar simultaneamente Amostras de leite controle positivo e negativo

23 Técnica do teste Equilibrar a temperatura do leite e do antígeno a temperatura ambiente mínimo 60 min Misturar bem a amostra de leite (inverter) 1 ml leite no tubo vidro (2 cm de coluna) Quantidade de leite número vacas lactação 30 µl do antígeno Tampar e homogeneizar (inverter várias vezes)

24 Técnica do teste Manter em repouso por 1 min Observar se está bem homogêneo não pode sobrar antígeno na parede do tubo Incubar a 37ºC / 1 hora Retirar grade com delicadeza Leitura dos resultados

25 Técnica do teste RESULTADOS Anel de creme Coluna de leite Resultado do rebanho AZUL BRANCA / AZULADA REAGENTE (+) BRANCO AZUL NÃO REAGENTE (-) Leite = rebanho reagente: testes sorológicos individuais em todos animais do rebanho em lactação (AAT)

26 Anel de creme Coluna de leite negativo positivo

27 Universidade Federal de Pelotas Medicina Veterinária Zoonoses Diagnóstico laboratorial Brucelose TESTE DO ANTÍGENO ACIDIFICADO TAMPONADO (AAT) Profª Drª Fernanda de Rezende Pinto DVP FV UFPel

28 Teste do AAT Triagem Muito sensível Fácil execução MV habilitado / laboratório credenciado / oficial credenciado Soro do animal

29 Falso-positivo: 2 fatores Anticorpos não específicos: Infecções por bactérias: Yersinia enterocolitica 0:9, Salmonella sp, Escherichia coli 0:157, Pseudomonas sp. Resultado da vacinação com B19 após a idade recomendada (acima 8 meses) Conhecimento da dinâmica das imunoglobulinas nos diferentes estágios da resposta imune

30 Resposta imune infecção e vacinação Bactéria intracelular macrófagos Resposta imune celular: fagocitárias Resposta imune humoral Acs específicos cadeia O LPS da B. abortus Imunoglobulinas em soro bovídeo: Classe G (IgG 1 e IgG 2) seguidas de: Classe M (IgM) Classe A (IgA) Infecção B. abortus ou vacinação com B 19

31 Resposta dos principais isotipos de anticorpos em bovinos infectados com amostra patogênica de Brucella abortus ou vacinados com B19. 1º = IgM 2º = IgG 1 Pós-infecção ou pós-vacinação (a partir da 1ª semana) (IgM) IgG 2 e IgA = mais tarde, aumentam gradativamente, mas permanecem níveis baixos

32 Resposta a longo tempo dos principais isotipos de anticorpos em bovinos infectados com amostra patogênica de Brucella abortus. Leve decréscimo IgM IgG 1 permanece alto, inalterado IgG 2 e IgA permanecem níveis baixos e estáveis Infecção crônica B. abortus IgG

33 Título de Anticorpos em UI Título de anticorpos em bovinos infectados com Brucella abortus ao longo do tempo IgG1 IgM IgA IgG Tempo em meses

34 Resposta a longo tempo dos principais isotipos de anticorpos em bovinos vacinados com a amostra B19 de Brucella abortus. Vacinados até 8 meses (3 8 meses) Títulos Acs decrescem rapidamente depois 12 meses Vacinação com B 19 Vacinação acima 8 meses Títulos vacinais elevados por mais tempo (Falso + )

35 Título de Anticorpos em UI Título de anticorpos em bezerras vacinadas entre 3 e 8 meses de idade com Brucella abortus amostra B IgG1 IgM IgA IgG Tempo em meses

36 TAAT Teste de aglutinação: soroaglutinação (Ag + Acs = grumos) Antígeno: Células inteiras da amostra de B. abortus a concentração de 8% Tamponado em ph ácido (3,65) (inibe IgG) Corado com o Rosa de Bengala A maioria dos soros de animais bacteriologicamente positivos apresenta reação a essa prova

37 TAAT Pode ocorrer alguns poucos casos de reações falso + em decorrência da utilização da vacina B19 Toda reação positiva nesse teste confirmada por testes de maior especificidade para se evitar o sacrifício de animais não infectados Prova qualitativa: não indica o título de anticorpos do soro testado.

38 Vacina B19 Amostra B. abortus lisa Brasil: obrigatória bezerras 3 8 meses Atenuada para fêmeas jovens Machos: orquite Fêmeas gestantes: aborto Lisa anticorpos específicos contra LPS liso interferência diagnóstico sorológico Persistência dos Acs relacionado à idade de vacinação

39 Vacina B19 Fêmea vacinada > 8 meses: Acs permanecem e interferem por mais de 24 meses Vacina até 8 meses: Acs desaparecem rapidamente: animais > 24 meses são negativos ao teste

40 Vacina RB 51 Amostra de B. abortus rugosa atenuada Proteção semelhante à B 19 Rugosa: não induz formação Acs anti-lps liso Não interfere na sorologia Não indutora de Acs aglutinantes Brasil: vacinação estratégica fêmeas adultas Viva: mesmos cuidados que B 19

41 Animais que devem ser testados Fêmeas igual ou > 24 meses (vacinadas 3 8 m) Machos e fêmeas não vacinadas igual ou > 8 m (exclui castrado) Fêmeas vacinadas (B 19) podem ser testadas? Sim. Idade igual ou > 24 meses

42 Colheita de sangue Sangue soro Tubos com vácuo (sem anticoagulante) Siliconados: facilita a retração do coágulo Agulhas individuais e descartáveis Sangue: 50% tubo 10 ml Tubos a T.A. (2 a 3 horas), abrigo da luz boa coagulação Soro: frasco limpo e seco Enviar para laboratório rapidamente (resfriado ou congelados) Identificação correta frascos

43 Protocolo Antígeno para AAT Soros a testar Soros controles positivo e negativo Pipetas de Bang Micropipetador de 30 µl (0,03 ml) Ponteiras Placa de vidro quadrados delimitados 4 cm x 4 cm Misturador de plástico ou metal Caixa de luz indireta para leitura Agitador de placa (opcional)

44 Protocolo Antígeno para AAT Compra: habilitado / controlado pela MAPA / adquirido no serviço de DSA Estadual Conservados sob refrigeração (2 C a 8 C) Usados sempre dentro do prazo de validade Não podem ser congelados

45 Cuidados na execução Antígeno não em uso: manter 2 a 8 ºC (perda da sensibilidade por resfriar/aquecer Temperatura de execução: 22ºC ± 4ºC Limpar material após uso (placas, pipetas, misturadores) Soros muito hemolisados = desprezados Falso + Controle positivo e negativo da reação

46 Técnica Equilibrar soro e antígeno T.A. (30 min) Soro congelado: tempo maior Homogeneizar soros (cuidado!) Identificar área da placa 30 µl de soro por área da placa encostar pipeta num ângulo 45º Agitar suavemente antígeno 30 µl ao lado do soro (sem misturar)

47 Técnica Misturar soro e Ag com misturador (círculo 2 cm diâmetro) Agitar a placa movimentos oscilatórios (30 movimentos / minuto) por 4 minutos Colocar placa na caixa de leitura Anotar resultados Desconsideram reações de aglutinação que ocorrem após os 4 minutos

48 Técnica Reação positiva Resultado Presença de grumos Reagente Ausência de grumos Não reagente Positiva Negativa

49 DIAGNÓSTICO de BRUCELOSE 2-ME 2-ME (RETESTE) Fonte: Comitê Científico Consultivo do PNCEBT

50 Lógica de testes em propriedades livres Propriedade infectada Propriedade não infectada (+) (+) (-) (-) (-) teste 1 teste 2 teste 3 teste 4 teste 5 saneamento (-) (-) (-) Propriedade livre teste 1 teste 2 teste 3 Propriedade livre Propriedade livre com reinfecção saneamento (+) (+) (-) (-) teste 1 teste 2 teste 3 teste 4 Fonte: Comitê Científico Consultivo do PNCEBT saneamento Propriedade livre

51 Fonte: Comitê Científico Consultivo do PNCEBT ETAPAS DE SANEAMENTO - BRUCELOSE Enquanto houver animais reagentes positivos, deve-se continuar realizando testes e sacrifício desses animais. O intervalo entre esses testes deve ser de 30 a 90 dias, até que se obtenha resultado negativo de TODOS os animais examinados. O procedimento até obtenção do certificado pode ser visto no esquema seguinte: AAT teste do antígeno acidificado tamponado 2-ME teste do 2-mercaptoetanol FC teste de fixação do complemento