Cultura microbiológica do leite na fazenda: uma nova ferramenta para o diagnóstico de mastite

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1 sanidade Texto: Susana N. de Macedo Cristina S. Cortinhas Marcos V. dos Santos Cultura microbiológica do leite na fazenda: uma nova ferramenta para o diagnóstico de mastite O tratamento para os casos de mastite clínica varia de acordo com o patógeno, que somente pode ser identificado após a realização da cultura microbiológica do leite. Nestes casos de mastite, os sistemas de diagnóstico microbiológico na fazenda possibilitam a tomada de decisão adequada quanto à utilização ou não de terapia antimicrobiana. Se as amostras forem coletadas e processadas de forma estéril a cultura microbiológica na fazenda apresenta boa acurácia e é uma ferramenta para a elaboração de uma terapia adequada para cada caso de mastite. maio 2013 REVISTA LEITE INTEGRAL 6

2 Introdução A mastite é um dos grandes gargalos da pecuária leiteira, motivo de redução na qualidade e quantidade de leite produzido. Caracterizada como processo inflamatório da glândula mamária causado por microrganismos, a mastite é a doença responsável pela utilização de grande parte dos antibióticos em rebanhos leiteiros. No mundo inteiro, é crescente a pressão para a redução do uso de antibióticos em animais de produção, pois existe risco de que o uso irrestrito destes antibióticos pode ser responsável por aumento da resistência aos antimicrobianos em medicina humana. Desta forma, faz-se necessário o conhecimento de informações que orientem os técnicos em relação à tomada de decisões quanto aos protocolos de tratamento da mastite a serem utilizados. A cultura microbiológica do leite na fazenda é uma técnica já utilizada em outros países que, de forma geral, identifica a presença do microrganismo no quarto mamário e fornece determinada classificação, importantes na tomada de decisões quanto à utilização de tratamentos. Especificamente, a cultura microbiológica de leite na fazenda auxilia nas decisões de tratamento para casos de mastite clínica e na utilização da terapia seletiva da vaca seca, além de identificar determinadas espécies de microrganismos. Decisões de tratamento de mastite clínica A mastite clínica pode ser causada por grande diversidade de bactérias e a utilização de uma terapia apropriada para esses casos é uma decisão que deve ser tomada com base em informações específicas sobre o agente, a vaca e o tipo de droga a ser usado. Para estabelecer um esquema de tratamento adequado é fundamental conhecer o patógeno causador a fim de escolher um antimicrobiano com um espectro de atividade apropriado. Os objetivos do tratamento da mastite são a prevenção da doença sistêmica, o rápido retorno da vaca para a ordenha e a produção de leite comercializável. Para o estabelecimento de um protocolo de tratamento efetivo, é necessária a avaliação de fatores de risco, tais como a idade e o histórico de mastite da vaca, além do conhecimento do provável patógeno. Em geral, quando a mastite é causada por patógenos Gram-positivos, é necessário tratamento intramamário com antibióticos. Já para a mastite causada por patógenos Gram-negativos, o tratamento com antibióticos pode não ser necessário. Também há casos que o próprio sistema imune da vaca pode combater o patógeno, em particular nos casos em que a cultura microbiológica é negativa. Em um estudo realizado no Canadá, 43,9% de mais de 3 mil amostras de leite de vacas com mastite clínica apresentaram resultado negativo na cultura microbiológica. No Brasil, o índice de amostras negativas é de aproximadamente 25%. Em um estudo com sete antimicrobianos para tratamento de mastite, apenas os patógenos Gram-positivos apresentaram taxa de cura que justificasse o tratamento com antibióticos. Já para os casos de mastite clínica, em cerca de 50 a 80% dos casos não foi necessário o uso de antimicrobianos. As infecções causadas por patógenos Gram-negativos geralmente apresentam alta taxa de cura espontânea, entretanto, algumas cepas podem apresentar fatores de virulência que aumentam a persistência na glândula mamária. Nestes casos, pode ser necessário o uso de protocolos de tratamento com maior duração. Sendo assim, a terapia antimicrobiana deve ser utilizada somente em casos de mastite causada por patógenos que respondem ao tratamento com antibióticos. Dessa forma, descarta-se menos leite com resíduo e o custo por caso de mastite pode reduzir. Para atingir esse objetivo, pode ser utilizado um sistema de análise de cultura microbiológica do leite na fazenda. O princípio básico desse método é limitar o uso de antimicrobianos e, consequentemente, reduzir a quantidade de leite descartado, além de estabelecer uma terapia de duração adequada para cada caso. Terapia da vaca seca seletiva Desde o desenvolvimento do plano de controle da mastite nos anos 1960, tem sido recomendada a prática de tratar todas as vacas na secagem com um antibiótico intramamário. O objetivo da terapia da vaca seca é eliminar infecções existentes e prevenir novas infecções durante o período seco. As infecções intramamárias que ocorrem neste período contribuem significativamente para o aumento no número de quartos infectados na lactação seguinte e para a consequente redução da produção de leite. A terapia da vaca seca consiste na infusão intramamária de antibiótico de longa ação específico para esse fim, em cada quarto mamário, após a última ordenha antes da secagem. Com o uso da terapia da vaca seca maio 2013 REVISTA LEITE INTEGRAL 7

3 sanidade há aumento da taxa de cura em relação aos tratamentos realizados durante a lactação e diminuição do custo, pois não há descarte de leite com resíduos de antibióticos. Se for respeitado o período seco de pelo menos 60 dias é mínimo o risco de ocorrer resíduos no leite após o parto. Porém, é crescente a preocupação com o uso indiscriminado de antibióticos em animais de produção e o uso da terapia da vaca seca em todos os animais tem sido questionado em alguns países nos quais o controle de mastite contagiosa já atingiu padrões de excelência. Nestes países, uma alternativa é o uso da terapia da vaca seca seletiva. Este método consiste na aplicação do tratamento da vaca seca em apenas algumas vacas ou quartos, baseando-se na cultura microbiológica ou na CCS. Com a realização da cultura microbiológica do leite na fazenda, é possível selecionar quais animais devem receber o tratamento na secagem e quais podem ser tratadas somente com o selante de tetos. Os resultados da adoção dessa prática são evidenciados num curto prazo em rebanhos com alta incidência de mastite contagiosa. Nos casos de infecções crônicas, nem sempre a terapia da vaca seca é efetiva, mas é preciso realizar os procedimentos de forma adequada, pois, caso contrário, podem ocorrer novas infecções. Portanto, é necessário Cultura microbiológica do leite na fazenda: uma nova ferramenta para o diagnóstico de mastite Nos casos de infecções crônicas, nem sempre a terapia da vaca é efetiva, mas é preciso realizar os procedimentos de forma adequada, pois, caso contrário, podem ocorrer novas infecções. seguir o protocolo de tratamento de forma correta e respeitar a duração de pelo menos 60 dias do período seco. Metodologias de cultura na fazenda Para o sucesso da utilização da cultura de leite na fazenda faz-se necessário conhecer a classificação da mastite clínica segundo o seu o grau de gravidade, descrita na tabela 1. De forma prática, se o caso de mastite for classificado com gravidade de grau 1 ou 2 uma amostra de leite é coletada para realização da cultura microbiológica na fazenda e nenhum antibiótico é aplicado até que se saiba o resultado (geralmente 24 horas). Se o caso de mastite for classificado como grau 3, o animal é tratado com protocolo específico para casos de mastite aguda e a cultura do leite não é realizada. Os procedimentos para a realização de uma cultura microbiológica bem sucedida se iniciam com a coleta de leite, do quarto mamário com mastite, antes da ordenha e de forma asséptica. Para tanto, são necessários frascos estéreis, algodão ou papel e álcool 70%, para desinfecção dos tetos. A cultura microbiológica do leite proveniente de um quarto mamário pode apresentar crescimento de um ou no máximo dois agentes causadores de mastite, mas se houver o crescimento de três tipos de microrganismos, a amostra deve ser Tabela 1. Escala de classificação da mastite quanto ao grau de gravidade da mastite clínica. Grau de severidade Sintomas clínicos 1 (leve) Leite anormal 2 (moderado) Leite anormal + alterações no úbere 3 (grave) Leite anormal + alterações no úbere + vaca doente Figura 1. Petrifilme para contagem de aeróbios maio 2013 REVISTA LEITE INTEGRAL 8

4 sanidade Cultura microbiológica do leite na fazenda: uma nova ferramenta para o diagnóstico de mastite Figura 2. Petrifilme para contagem de coliformes Figura 3. Estufa para incubação considerada contaminada. Atualmente, as metodologias mais utilizadas para a cultura microbiológica na fazenda são a por Petrifilme (Canadá) (Figura 4) e a em meios de cultura (Minnesota EUA) (Figura 7). A metodologia canadense consiste na inoculação de um microlitro de leite diluído (1:10), em placas petrifilme (3M) para contagem de aeróbios (Figura 1) e para a contagem coliformes (Figura 2), incubação em estufa (Figura 3) à 35ºC por 24hs e leitura manual. Nesta metodologia os agentes causadores de mastite são classificados como Gram-positivos, Gram- -negativos ou sem crescimento, com sensibilidade (identificação dos positivos) de 93,8% e valor preditivo negativo (identificação de negativos) de 89,7%. A metodologia americana (Minnesota Easy Culture System II) é realizada em meios de culturas que permitem a identificação de bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e, dependendo do meio de cultura utilizado, é possível ter Figura 4. Metodologia utilizada para a cultura microbiológica na fazenda por petrifilme (Canadá). 1 o passo 2 o passo Leitura Petrifilm para aeróbios Leitura Petrifilm para coliformes < 20 colônias > 20 colônias > 5 colônias < 5 colônias Gram-positivo antibiótico de acordo com o protocolo da fazenda Não tratar; Baixa contagem de bactérias Gram-negativo Não tratar um diagnóstico presuntivo do agente causador. Nesta metodologia são utilizadas placas descartáveis bipartidas ou tripartidas com os seguintes meios de cultura: Placas bipartidas divididas em meio de cultura Factor e MacConkey seletivos para crescimento de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, respectivamente (Figura 5). Placas tripartidas divididas em meio de cultura Factor, TKT modificado e MacConkey seletivos para crescimento de bactérias Gram-positivas, bactérias do gênero estreptococos e bactérias Gram-negativas, respectivamente (Figura 6). Após a coleta, as amostras de leite são inoculadas em toda superfície das placas bi ou tripartidas com o auxílio de um swab estéril, são incubadas à 37ºC em estufa (Figura 3) e a leitura é realizada após 24hs. Para o sistema Minnesota Easy Culture System II a sensibilidade e valor preditivo negativo são 97,9% e 96,4%, respectivamente. De forma geral, a grande diferença entre os sistemas de cultura canadense e americano é a durabilidade dos meios de cultura. Os petrifilmes têm uma durabilidade (meia vida) de um ano, enquanto a durabilidade das placas bipartidas ou tripartidas é de seis semanas. Desta forma, em fazendas de pequeno porte, a utilização de placas petrifilme torna-se mais indicada. Uma das dificuldades para a implementação de um sistema de cultura microbiológica do leite na fazenda é a necessidade de um local apropriado para o laboratório. É imprescindível que o maio 2013 REVISTA LEITE INTEGRAL 10

5 Figura 5. Placa bipartida para identificação de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas Figura 6. Placa tripartida para identificação de Gram-negativas, Gram-positivas e estreptococos. Pesquisadores americanos avaliaram o uso da cultura microbiológica do leite em uma fazenda com rebanho leiteiro de 600 vacas que apresentava Bactérias Gram-positivas (Factor) Bactérias Gram-negativas (MacConkey) Bactérias Gram-negativas (MacConkey) Bactérias Gram-positivas (Factor) Bactérias do gênero estreptococcos (MTKT) mesmo esteja localizado em área limpa, coletadas e processadas de forma esté- bem iluminada, com temperatura es- ril para que não haja contaminação du- tável e longe de áreas de preparação e rante os procedimentos e os resultados estocagem de alimentos. Outra dificul- sejam confiáveis, por isso, a presença de dade é a necessidade de equipamen- uma pessoa treinada para ler as placas tos: um freezer, um refrigerador, uma e avaliar os resultados é um fator deter- estufa, em uma área de trabalho de fácil minante para o sucesso da implantação acesso. As amostras de leite devem ser desta metodologia. problemas com mastite clínica e excessivo uso de antibióticos. Para cada caso clínico foram coletadas duas amostras, sendo uma para análise na fazenda pelo método canadense (Petrifilm) e outra enviada para um laboratório especia- As amostras de leite devem ser coletadas e processadas de forma estéril para que não haja contaminação durante os procedimentos e os resultados sejam confiáveis.

6 sanidade Cultura microbiológica do leite na fazenda: uma nova ferramenta para o diagnóstico de mastite Figura 7. Metodologia utilizada para a cultura microbiológica na fazenda em meios de cultura (Minnesota EUA). Lote de tratamento 1)Banamine 2) Fluidos orais 3) Febre Vaca com mastite clínica Exame físico Cultura microbiológica Sem febre Lote de vacas com mastite 1) Aguardar resultado da cultura microbiológica 2) Gram-positiva Gram-negativa Streptococcus agalactiae Staphylococcus aureus Staphylococcus sp. Streptococcus ambientais Coliformes antibiótico intramamário em todos os quartos; microbiológico; antibiótico intramamário; microbiológico; Descarte antibiótico intramamário; microbiológico; Descarte antibiótico intramamário Não tratar com antibióticos; Banamine (se tiver febre); Sem crescimento Não tratar com antibióticos; Banamine (se tiver febre); Quarto perdido Resposta Descarte Retorno para o rebanho lizado. O treinamento adequado do funcionário para a correta interpretação dos resultados do Petrifilm foi essencial para o correto diagnóstico. O uso da cultura microbiológica na fazenda foi uma ferramenta efetiva para a adoção de um protocolo de tratamento racional e, consequentemente, redução do custo com antimicrobianos e descarte do leite de US$ 264 para US$ 90 por caso de mastite. Conclusão O tratamento para os casos de mastite clínica (de leve a moderada ou graus 1 e 2) varia de acordo com o patógeno, que somente pode ser identificado após a realização da cultura microbiológica do leite. Nestes casos de mastite, os sistemas de diagnóstico microbiológico na fazenda possibilitam a tomada de decisão adequada quanto à utilização ou não de terapia antimicrobiana. Se as amostras forem coletadas e processadas de forma estéril, independentemente do método utilizado (Minnesota ou por Petrifilm), a cultura microbiológica na fazenda apresenta boa acurácia e é uma ferramenta para a elaboração de uma terapia adequada para cada caso de mastite. Entretanto, qualquer que seja o sistema utilizado, é importante submeter rotineiramente amostras de leite para diagnóstico microbiológico em laboratórios especializados, para o controle de qualidade da técnica utilizada na propriedade A adoção de uma terapia diferenciada para cada caso de mastite diminui os custos com antibióticos e com o descarte do leite e eleva a eficácia do tratamento. A interpretação da cultura de leite deve estar associada aos fatores de risco, como idade e histórico de mastite da vaca, para que seja possível recomendar a melhor alternativa para cada caso: tratar ou não com antimicrobianos, segregar, secar ou descartar. Susana Nóri de Macedo Mestranda em Nutrição e Produção Animal FMVZ - USP Cristina Simões Cortinhas Mestranda em Nutrição e Produção Animal FMVZ - USP Marcos Veiga dos Santos Professor Associado da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo (FMVZ/USP) maio 2013 REVISTA LEITE INTEGRAL 12

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