Bio-Manguinhos IFI - CHAGAS. DOENÇA DE CHAGAS IFI - CHAGAS Bio-Manguinhos IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO T.

Transcrição

1 Tel.: (21) FAX: (21) SAC: DOENÇA DE CHAGAS IFI - CHAGAS Bio-Manguinhos IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO T.cruzi Tel.: (21) FAX: (21) SAC: DOENÇA DE CHAGAS IFI - CHAGAS Bio-Manguinhos IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO T.cruzi

2 2 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO T. cruzi (material fornecido para 600 reações) PRINCÍPIO DO TESTE: Este teste consiste na reação de soros ou plasmas hu ma nos, com os parasitas fi xados (T.cruzi), em lâminas de microscopia para fl uorescência. A reação entre o antígeno fi xado e o anticorpo presente nas amostras é visualizada após a adição de anti-imunoglobulina humana (Ig), conjugada com isotiocianato de fl uoresceína. Para a leitura da reação deve-se utilizar microscópio para fl uorescência. ESQUEMA DO TESTE: Reação Positiva parasitas + amostra + conjugado = fluorescência positiva Reação Negativa + luz azul e ultravioleta parasitas + amostra + conjugado = ausência de fluorescência negativa + luz azul e ultravioleta ENSAIO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA DOENÇA DE CHAGAS MODELO DE PROTOCOLO Instituição: IFI nº: Data: / / Antígeno: Lote: Validade: Conjugado: Lote: Validade: Diluição: Lâmina nº: Lâmina nº: Técnico responsável: Observações: 15 2 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO T. cruzi (material fornecido para 600 reações) PRINCÍPIO DO TESTE: Este teste consiste na reação de soros ou plasmas hu ma nos, com os parasitas fi xados (T.cruzi), em lâminas de microscopia para fl uorescência. A reação entre o antígeno fi xado e o anticorpo presente nas amostras é visualizada após a adição de anti-imunoglobulina humana (Ig), conjugada com isotiocianato de fl uoresceína. Para a leitura da reação deve-se utilizar microscópio para fl uorescência. ESQUEMA DO TESTE: Reação Positiva + luz azul e ultravioleta ENSAIO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA DOENÇA DE CHAGAS MODELO DE PROTOCOLO Instituição: IFI nº: Data: / / Antígeno: Lote: Validade: Conjugado: Lote: Validade: Diluição: Lâmina nº: parasitas + amostra + conjugado = fluorescência positiva Reação Negativa + luz azul e ultravioleta Lâmina nº: parasitas + amostra + conjugado = ausência de fluorescência negativa Técnico responsável: Observações:

3 14 3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: - CAMARGO, M.E. & REBONATO, C.; Cross-reactivity in immunofl uorescence for Trypanosoma and Leishmania antibodies. Am. J. Trop. Med. Hyg.; 18: CAMARGO, M.E. ; TAAKEDA, G.K.F.; Diagnóstico de laboratório. Brener Z., Andrade, Z. eds. Trypanosoma cruzi e Doença de chagas. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan ZICKER, F.; SMITH, P.G. et al.; Mass screening for Trypanosoma cruzi infections using the immunofluorescence, ELISA and haemaglutination test s on serum samples and on blood eluates from fi lter-paper. Bull. World Health Organ. 68: ZAUZA P.L Avaliação dos níveis de anticorpos (IgG) anti T. cruzi em soros de pacientes chagásicos crônicos de Virgem da Lapa. Minas Gerais, Brasil. Tese de Mestrado, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. p.132. ASSISTÊNCIA AOS USUÁRIOS: Orientações técnicas adicionais a respeito deste produto poderão ser obtidas junto a: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos Bio-Manguinhos Fiocruz CNPJ: / Av. Brasil, Manguinhos -CEP: Rio de Janeiro - RJ SAC: sac.reativos@bio.fi ocruz.br Fax: (21) ocruz.br BM_004_04Bk edição: fevereiro de 2009 MATERIAL FORNECIDO: Identifi cação Componentes Apresentação R-01 Suspensão de Antígeno 1 Fr. 6 ml R-02 Controle Positivo 1 Fr. 0,3 ml R-03 Controle Negativo 1 Fr. 0,3 ml R-04 Anti-Ig hum. conjug. c/ fl uoresceína 1 Fr. 0,3 ml R-05 Glicerina Tamponada ph 9,0 + 0,5 2 Fr. 5 ml R-06 Azul de Evans 0,1 % 1 Fr. 1 ml R-07 Lâminas para IFI 50 R-08 Lamínulas 50 Manual de Instruções de Uso MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO: - Tampão fosfato/salina (PBS) - ph 7,2. - Microplacas e micropipetas com volumes variáveis ou tu bos e pipetas para diluições. - Câmara úmida. - Cubas para lavagem de lâminas (tipo Koplin). - Luvas descartáveis. - Água destilada. - Hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária. - Recipiente para descarte de material contaminado. - Vidraria básica em geral (tubos, pipetas, provetas, etc). - Estufa a 37 o C. - Microscópio para fl uorescência. CONSERVAÇÃO E ESTOCAGEM DO MATERIAL: Manter entre 2 o e 8 o C: R-01, R-02, R-03, R-04, R-05, R-06. Todos os componentes do kit devem ser guardados nas temperaturas indicadas desde o ato do recebimento do conjunto, permanecendo estáveis pela validade defi nida na caixa principal do kit. Obs.: a temperatura de transporte, com bobinas de gelo reciclável, permite que o conjunto se mantenha em condições adequadas durante 24 a 36 horas REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: - CAMARGO, M.E. & REBONATO, C.; Cross-reactivity in immunofl uorescence for Trypanosoma and Leishmania antibodies. Am. J. Trop. Med. Hyg.; 18: CAMARGO, M.E. ; TAAKEDA, G.K.F.; Diagnóstico de laboratório. Brener Z., Andrade, Z. eds. Trypanosoma cruzi e Doença de chagas. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan ZICKER, F.; SMITH, P.G. et al.; Mass screening for Trypanosoma cruzi infections using the immunofluorescence, ELISA and haemaglutination test s on serum samples and on blood eluates from fi lter-paper. Bull. World Health Organ. 68: ZAUZA P.L Avaliação dos níveis de anticorpos (IgG) anti T. cruzi em soros de pacientes chagásicos crônicos de Virgem da Lapa. Minas Gerais, Brasil. Tese de Mestrado, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. p.132. ASSISTÊNCIA AOS USUÁRIOS: Orientações técnicas adicionais a respeito deste produto poderão ser obtidas junto a: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos Bio-Manguinhos Fiocruz CNPJ: / Av. Brasil, Manguinhos -CEP: Rio de Janeiro - RJ SAC: sac.reativos@bio.fi ocruz.br Fax: (21) ocruz.br BM_004_04Bk edição: fevereiro de 2009 MATERIAL FORNECIDO: Identifi cação Componentes Apresentação R-01 Suspensão de Antígeno 1 Fr. 6 ml R-02 Controle Positivo 1 Fr. 0,3 ml R-03 Controle Negativo 1 Fr. 0,3 ml R-04 Anti-Ig hum. conjug. c/ fl uoresceína 1 Fr. 0,3 ml R-05 Glicerina Tamponada ph 9,0 + 0,5 2 Fr. 5 ml R-06 Azul de Evans 0,1 % 1 Fr. 1 ml R-07 Lâminas para IFI 50 R-08 Lamínulas 50 Manual de Instruções de Uso MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO: - Tampão fosfato/salina (PBS) - ph 7,2. - Microplacas e micropipetas com volumes variáveis ou tu bos e pipetas para diluições. - Câmara úmida. - Cubas para lavagem de lâminas (tipo Koplin). - Luvas descartáveis. - Água destilada. - Hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária. - Recipiente para descarte de material contaminado. - Vidraria básica em geral (tubos, pipetas, provetas, etc). - Estufa a 37 o C. - Microscópio para fl uorescência. CONSERVAÇÃO E ESTOCAGEM DO MATERIAL: Manter entre 2 o e 8 o C: R-01, R-02, R-03, R-04, R-05, R-06. Todos os componentes do kit devem ser guardados nas temperaturas indicadas desde o ato do recebimento do conjunto, permanecendo estáveis pela validade defi nida na caixa principal do kit. Obs.: a temperatura de transporte, com bobinas de gelo reciclável, permite que o conjunto se mantenha em condições adequadas durante 24 a 36 horas.

4 4 13 CUIDADOS E PRECAUÇÕES: -Este conjunto diagnóstico contém produtos biológicos e químicos, podendo representar uma fonte de infecção. Portanto, ao manusear qualquer um dos reagentes desse conjunto, observe as precauções de biosegurança necessárias. A qualidade dos resultados obtidos com este conjunto diagnóstico depende do cumprimento às boas normas de segurança do laboratório, tais como: - as amostras, assim como os controles, podem conter agentes infecciosos e devem ser manipulados com cuidado; - homogeneizar as amostras e controles antes de usar; - utilizar equipamento de proteção individual (EPI), tais como luvas descartáveis, jaleco e protetor facial em todas as etapas do teste; - desprezar ponteiras, luvas, pipetas de vidro, frascos, lâminas usadas, etc., em solução de hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária; - nunca misturar componentes de lotes diferentes; - todos os frascos utilizados para diluir os componentes devem ter sido muito bem limpos, secos e desengordurados; - para evitar interferências, nunca tocar com os dedos na parte superior das lâminas; - nunca reaproveitar as lâminas; - utilizar frascos e vidrarias rigorosamente limpos, pois resíduos de detergentes e/ou substâncias oxidantes poderão interferir na reação; - não utilizar os reativos após sua data de validade. PREPARO DO TAMPÃO FOSFATO ph 7,2 (PBS): Sais Quantidade Cloreto de Sódio (NaCl) PA - 0,15M 8,77 g Fosfato de Sódio Dibásico Anidro (Na 2 HPO 4 ) PA - 0,0072M 1,02 g Fosfato de Sódio Monobásico Anidro (NaH 2 PO 4 ) PA - 0,0028M 0,34 g Água destilada q.s.p. (quantidade sufi ciente para) 1000 ml Amostra reagente Presença de fl uorescência em todos os parasitas nas diluições 1:40 e 1:80. Amostra não reagente Ausência de fl uorescência em todos os parasitas, nas dilluições 1:40 e 1:80, conforme o poço do controle negativo (1:40). Indeterminado Presença de fl uorescência em todos os parasitas na diluição 1:40 e ausência de fl uorescência na diluição 1:80. Neste caso, recomendamos que a amostra seja submetida a repetição do teste para confi rmação do resultado. Qualquer padrão diferente dos descritos anteriormente. Neste caso, repita a reação e persistindo o resultado, submeta a amostra a outra metodologia. ATENÇÃO: é recomendada a utilização de pelo menos duas metodologias, de princípios diferentes, para caracterização do diagnóstico laboratorial da Doença de Chagas, devendo-se ainda, considerar o diagnóstico clínico CUIDADOS E PRECAUÇÕES: -Este conjunto diagnóstico contém produtos biológicos e químicos, podendo representar uma fonte de infecção. Portanto, ao manusear qualquer um dos reagentes desse conjunto, observe as precauções de biosegurança necessárias. A qualidade dos resultados obtidos com este conjunto diagnóstico depende do cumprimento às boas normas de segurança do laboratório, tais como: - as amostras, assim como os controles, podem conter agentes infecciosos e devem ser manipulados com cuidado; - homogeneizar as amostras e controles antes de usar; - utilizar equipamento de proteção individual (EPI), tais como luvas descartáveis, jaleco e protetor facial em todas as etapas do teste; - desprezar ponteiras, luvas, pipetas de vidro, frascos, lâminas usadas, etc., em solução de hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária; - nunca misturar componentes de lotes diferentes; - todos os frascos utilizados para diluir os componentes devem ter sido muito bem limpos, secos e desengordurados; - para evitar interferências, nunca tocar com os dedos na parte superior das lâminas; - nunca reaproveitar as lâminas; - utilizar frascos e vidrarias rigorosamente limpos, pois resíduos de detergentes e/ou substâncias oxidantes poderão interferir na reação; - não utilizar os reativos após sua data de validade. PREPARO DO TAMPÃO FOSFATO ph 7,2 (PBS): Amostra reagente Presença de fl uorescência em todos os parasitas nas diluições 1:40 e 1:80. Amostra não reagente Ausência de fl uorescência em todos os parasitas, nas dilluições 1:40 e 1:80, conforme o poço do controle negativo (1:40). Indeterminado Presença de fl uorescência em todos os parasitas na diluição 1:40 e ausência de fl uorescência na diluição 1:80. Neste caso, recomendamos que a amostra seja submetida a repetição do teste para confi rmação do resultado. Qualquer padrão diferente dos descritos anteriormente. Neste caso, repita a reação e persistindo o resultado, submeta a amostra a outra metodologia. ATENÇÃO: é recomendada a utilização de pelo menos duas metodologias, de princípios diferentes, para caracterização do diagnóstico laboratorial da Doença de Chagas, devendo-se ainda, considerar o diagnóstico clínico. Sais Quantidade Cloreto de Sódio (NaCl) PA - 0,15M 8,77 g Fosfato de Sódio Dibásico Anidro (Na2 HPO ) PA - 0,0072M 1,02 g 4 Fosfato de Sódio Monobásico Anidro (NaH2 PO ) PA - 0,0028M 0,34 g 4 Água destilada q.s.p. (quantidade sufi ciente para) 1000 ml

5 12 5 nº lâminas Vol. PBS Vol. Azul de Evans(AE) 0,1% 1 ou 2 0,48 ml 20 µl 3 ou 4 0,96 ml 40 µl 5 ou 6 1,44 ml 60 µl 10- Diluir o conjugado anti-imunoglobulina (Ig) humanafluoresceína, na proporção adequada obtida com a prévia titulação do conjugado, em PBS-AE. 11- Homogeneizar bem e adicionar 15 µl da diluição do conjugado em todos os poços das lâminas. 12- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C em estufa. 13- Lavar as lâminas, se possível com leve agitação rotacional, 14- Colocar as lâminas por aproximadamente 10 minutos a 37 C em estufa para secagem. 15- Adicionar de 3 a 4 gotas de glicerina tamponada sobre cada lâmina, cobrí-las com lamínulas, evitando a formação de bolhas. Mantê-las ao abrigo da luz e a seco, até o momento da leitura. LEITURA E INTERPRETAÇÃO : 1- Para a leitura e interpretação das reações, utilizar o microscópio de imunofl uorescência e objetiva de 40X. Focalizar a lâmina na posição do controle positivo e observar a fl uorescência presente, de acordo com o padrão descrito abaixo. 2- Focalizar a lâmina na posição do controle negativo e observar a ausência de fl uorescência nos parasitas, bem como a coloração de fundo background. 3- Proceder a leitura das amostras, considerando os padrões a seguir: ATENÇÃO: os sais descritos acima, quando não utilizados na forma anidra, deverão ter suas quantidades recalculadas em função das moléculas de água presentes. Verifi car sempre no rótulo dos produtos a composição dos sais e o peso molecular. Exemplo de correção de peso para preparo de PBS quando se utiliza o fosfato dibásico hidratado com 12 moléculas de água. Cálculo: Na 2 HPO 4 Anidro - Peso Molecular = 142 pesar 1,02 g Na 2 HPO 4.12H 2 O - Peso Molecular = 358 pesar X g 142-1,02 X = 1,02 x 358 = 2,57 g X 142 Neste exemplo, onde o Fosfato Dibásico é hidratado com 12 moléculas de água, devem-se pesar 2,57 g para preparar o PBS. TITULAÇÃO DO CONJUGADO: O título do conjugado varia em função das condições de trabalho, do microscópio utilizado e do operador. O laboratório deverá utilizar o controle negativo na diluição 1: 40, e controle positivo, com título conhecido, descrito no rótulo, entre 1:160 e 1:320, numa diluição abaixo do título do soro, na diluição correspondente ao título descrito no rótulo e numa diluição acima do título do controle positivo. Obs 1: os controles positivo e negativo, bem como os demais reagentes, deverão estar à temperatura ambiente para sua utilização. Obs 2: é INDISPENSÁVEL uma boa homogeneização da suspensão antigênica. 1- Retirar da embalagem duas lâminas de IFI e, após a homogeneização da suspensão antigênica, pingar 10 µl por poço; 2- Deixar secar por 30 a 60 minutos à 37 C, em estufa, ou overnight à temperatura ambiente; 12 5 nº lâminas Vol. PBS Vol. Azul de Evans(AE) 0,1% 1 ou 2 0,48 ml 20 µl 3 ou 4 0,96 ml 40 µl 5 ou 6 1,44 ml 60 µl 10- Diluir o conjugado anti-imunoglobulina (Ig) humanafl uoresceína, na proporção adequada obtida com a prévia titulação do conjugado, em PBS-AE. 11- Homogeneizar bem e adicionar 15 µl da diluição do conjugado em todos os poços das lâminas. 12- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C em estufa. 13- Lavar as lâminas, se possível com leve agitação rotacional, 14- Colocar as lâminas por aproximadamente 10 minutos a 37 C em estufa para secagem. 15- Adicionar de 3 a 4 gotas de glicerina tamponada sobre cada lâmina, cobrí-las com lamínulas, evitando a formação de bolhas. Mantê-las ao abrigo da luz e a seco, até o momento da leitura. LEITURA E INTERPRETAÇÃO : 1- Para a leitura e interpretação das reações, utilizar o microscópio de imunofl uorescência e objetiva de 40X. Focalizar a lâmina na posição do controle positivo e observar a fl uorescência presente, de acordo com o padrão descrito abaixo. 2- Focalizar a lâmina na posição do controle negativo e observar a ausência de fl uorescência nos parasitas, bem como a coloração de fundo background. 3- Proceder a leitura das amostras, considerando os padrões a seguir: ATENÇÃO: os sais descritos acima, quando não utilizados na forma anidra, deverão ter suas quantidades recalculadas em função das moléculas de água presentes. Verifi car sempre no rótulo dos produtos a composição dos sais e o peso molecular. Exemplo de correção de peso para preparo de PBS quando se utiliza o fosfato dibásico hidratado com 12 moléculas de água. Cálculo: Na2 HPO 4 Na2 HPO 4.12H 2 Anidro - Peso Molecular = 142 pesar 1,02 g O - Peso Molecular = 358 pesar X g 142-1,02 X = 1,02 x 358 = 2,57 g X 142 Neste exemplo, onde o Fosfato Dibásico é hidratado com 12 moléculas de água, devem-se pesar 2,57 g para preparar o PBS. TITULAÇÃO DO CONJUGADO: O título do conjugado varia em função das condições de trabalho, do microscópio utilizado e do operador. O laboratório deverá utilizar o controle negativo na diluição 1: 40, e controle positivo, com título conhecido, descrito no rótulo, entre 1:160 e 1:320, numa diluição abaixo do título do soro, na diluição correspondente ao título descrito no rótulo e numa diluição acima do título do controle positivo. Obs 1: os controles positivo e negativo, bem como os demais reagentes, deverão estar à temperatura ambiente para sua utilização. Obs 2: é INDISPENSÁVEL uma boa homogeneização da suspensão antigênica. 1- Retirar da embalagem duas lâminas de IFI e, após a homogeneização da suspensão antigênica, pingar 10 µl por poço; 2- Deixar secar por 30 a 60 minutos à 37 C, em estufa, ou overnight à temperatura ambiente;

6 Fazer um protocolo de trabalho, indicando a posição das diluições do Controle Positivo (CP), e do Controle Negativo (CN), conforme a seguir: Homogeneizar suavemente evitando a formação de bolhas. 4- Diluir as amostras conforme esquema a seguir: 100 µl LÂMINA 1 Tubo 1 Tubo 2 dil.1:40 dil.1:80 5 µl de soro µl PBS µl PBS 100 µl dil.1:40 LÂMINA 2 CP * título = Diluição referente ao título do soro controle positivo para Doença de Chagas 4- Diluir o controle negativo (CN) 1:40 em PBS. Para realizar esta diluição utilizar 5 µl de soro e adicionar 195 µl de PBS. Homogeneizar suavemente, evitando a formação de bolhas. 5- Diluir o controle positivo (CP), utilizando o esquema de diluição seriada a seguir: 5- Adicionar 10 µl das diluições das amostras e controles positivo e negativo em cada poço das lâminas, seguindo seu protocolo de trabalho. ATENÇÃO: evitar que a ponta da ponteira toque ou raspe a superfície da lâmina, pois este procedimento provocará a retirada dos parasitas. Tomar cuidado para que o conteúdo de diferentes poços não se misturem. Utilizar uma ponteira para cada amostra ou controle a ser aplicado na lâmina. 6- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C, em estufa. 7- Lavar as lâminas, se possível com leve agitação rotacional, 8- Colocar as lâminas por aproximadamente 10 minutos a 37 C, em estufa, para secagem. 9- Preparar, momentos antes do uso, uma solução de PBS- Azul de Evans (PBS-AE), conforme tabela abaixo: Fazer um protocolo de trabalho, indicando a posição das diluições do Controle Positivo (CP), e do Controle Negativo (CN), conforme a seguir: Homogeneizar suavemente evitando a formação de bolhas. 4- Diluir as amostras conforme esquema a seguir: 100 µl LÂMINA 1 Tubo 1 Tubo 2 dil.1:40 dil.1:80 5 µl de soro µl PBS µl PBS 100 µl dil.1:40 LÂMINA 2 5- Adicionar 10 µl das diluições das amostras e controles positivo e negativo em cada poço das lâminas, seguindo seu protocolo de trabalho. ATENÇÃO: evitar que a ponta da ponteira toque ou raspe a superfície da lâmina, pois este procedimento provocará a retirada dos parasitas. Tomar cuidado para que o conteúdo de diferentes poços não se misturem. Utilizar uma ponteira para cada amostra ou controle a ser aplicado na lâmina. CP * título = Diluição referente ao título do soro controle positivo para Doença de Chagas 4- Diluir o controle negativo (CN) 1:40 em PBS. Para realizar esta diluição utilizar 5 µl de soro e adicionar 195 µl de PBS. Homogeneizar suavemente, evitando a formação de bolhas. 5- Diluir o controle positivo (CP), utilizando o esquema de diluição seriada a seguir: 6- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C, em estufa. 7- Lavar as lâminas, se possível com leve agitação rotacional, 8- Colocar as lâminas por aproximadamente 10 minutos a 37 C, em estufa, para secagem. 9- Preparar, momentos antes do uso, uma solução de PBS- Azul de Evans (PBS-AE), conforme tabela abaixo:

7 10 7 DEFINIÇÃO DO TÍTULO DO CONJUGADO: Para a leitura das reações e defi nição da diluição de uso do conjugado, utilizar o microscópio de imunofluorescência e objetiva com aumento de 40X. O título do conjugado corresponderá à diluição em que se observar o melhor padrão, conforme as características descritas a seguir. CN (dil. 1:40) Ausência de fl uorescência em todos os parasitas CP (dil. 1:160) Presença de fl uorescência de boa intensidade CP (dil. 1:320) Presença de fl uorescência de fraca intensidade CP (dil. 1:640) Ausência de fl uorescência, conforme CN (dil. 1:40) Atenção: excepcionalmente, se necessário, o usuário poderá ampliar a diluição do conjugado (1:700, 1:800,...) para defi nição do título a ser utilizado PROCEDIMENTO DO TESTE: 1- Fazer o protocolo de trabalho (vide modelo em anexo), podendo avaliar 5 amostras (diluição 1:40 e 1:80), por lâmina. ATENÇÃO: os controles positivo e negativo diluidos 1:40, devem estar presentes em todas as lâminas para comparações no momento da leitura. 2- Retirar da caixa as lâminas necessárias para testar as amostras. Não é necessário limpá-las. Homogeneizar a suspensão de antígeno e pingar 10 µl em cada orifício. Deixar na estufa a 37 C por 30 a 60 minutos até sua secagem, ou overnight à temperatura ambiente. ATENÇÃO: os controles positivo e negativo e os demais reagentes, deverão estar à temperatura ambiente para sua utilização. 3- Diluir os controles positivo e negativo 1:40 em PBS. Para realizar esta diluição utilizar 5 µl dos controles e adicionar 195 µl de PBS. 200 µl 200 µl 200 µl Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Diluição 1:80 Diluição 1:160 Diluição 1:320 Diluição 1: µl PBS 200 µl PBS 200 µl PBS 200 µl PBS + 5 µl de soro µl da dil µl da dil µl da dil. CP 1:80 1:160 1:320 ATENÇÃO: homogeneizar o conteúdo de cada tubo antes de transferir o volume de 200 µl para o tubo seguinte. 6- Conforme seu protocolo de trabalho (item 3), adicionar 10 µl da diluição 1:40 do controle negativo e 10 µl das diluições acima do título, da diluição correspondente ao título e da diluição acima do título do controle positivo, nos poços correspondentes. ATENÇÃO: o título para Doença de Chagas do controle positivo está descrito no rótulo do frasco. exemplo: Rótulo: IFI-CHAGAS - Bio-Manguinhos VS/MS: Controle Positivo Título: 1:320 Lote: Vol.: Val.: Cons.: Neste exemplo, utilizaríamos a diluição 1: DEFINIÇÃO DO TÍTULO DO CONJUGADO: Para a leitura das reações e defi nição da diluição de uso do conjugado, utilizar o microscópio de imunofluorescência e objetiva com aumento de 40X. O título do conjugado corresponderá à diluição em que se observar o melhor padrão, conforme as características descritas a seguir. CN (dil. 1:40) Ausência de fl uorescência em todos os parasitas CP (dil. 1:160) Presença de fl uorescência de boa intensidade CP (dil. 1:320) Presença de fl uorescência de fraca intensidade CP (dil. 1:640) Ausência de fl uorescência, conforme CN (dil. 1:40) Atenção: excepcionalmente, se necessário, o usuário poderá ampliar a diluição do conjugado (1:700, 1:800,...) para defi nição do título a ser utilizado PROCEDIMENTO DO TESTE: 1- Fazer o protocolo de trabalho (vide modelo em anexo), podendo avaliar 5 amostras (diluição 1:40 e 1:80), por lâmina. ATENÇÃO: os controles positivo e negativo diluidos 1:40, devem estar presentes em todas as lâminas para comparações no momento da leitura. 2- Retirar da caixa as lâminas necessárias para testar as amostras. Não é necessário limpá-las. Homogeneizar a suspensão de antígeno e pingar 10 µl em cada orifício. Deixar na estufa a 37 C por 30 a 60 minutos até sua secagem, ou overnight à temperatura ambiente. ATENÇÃO: os controles positivo e negativo e os demais reagentes, deverão estar à temperatura ambiente para sua utilização. 3- Diluir os controles positivo e negativo 1:40 em PBS. Para realizar esta diluição utilizar 5 µl dos controles e adicionar 195 µl de PBS. 200 µl 200 µl 200 µl Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Diluição 1:80 Diluição 1:160 Diluição 1:320 Diluição 1: µl PBS 200 µl PBS 200 µl PBS 200 µl PBS + 5 µl de soro µl da dil µl da dil µl da dil. CP 1:80 1:160 1:320 ATENÇÃO: homogeneizar o conteúdo de cada tubo antes de transferir o volume de 200 µl para o tubo seguinte. 6- Conforme seu protocolo de trabalho (item 3), adicionar 10 µl da diluição 1:40 do controle negativo e 10 µl das diluições acima do título, da diluição correspondente ao título e da diluição acima do título do controle positivo, nos poços correspondentes. ATENÇÃO: o título para Doença de Chagas do controle positivo está descrito no rótulo do frasco. exemplo: Rótulo: IFI-CHAGAS - Bio-Manguinhos VS/MS: Controle Positivo Título: 1:320 Lote: Vol.: Val.: Cons.: Neste exemplo, utilizaríamos a diluição 1:320.

8 8 9 ATENÇÃO: evitar que a ponta da ponteira toque ou raspe a superfície da lâmina, pois este procedimento provocará a retirada dos parasitas. Tomar cuidado para que o conteúdo de diferentes poços não se misturem. Utilizar uma ponteira para cada controle a ser utilizado. 7- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos, à 37 C, em estufa. 8- Lavar as lâminas, se possível com leve agitação rotacional, 9- Secar as lâminas por 10 minutos a 37 C, em estufa. 10- Preparar uma solução de PBS-Azul de Evans (PBS-AE) a 0,04%, colocar em um tubo 120 µl de Azul de Evans e 2880 µl de PBS. 11- Diluir o conjugado anti-imunoglobulina (Ig) humana marcada com fl uoresceína em PBS-AE, conforme descrito a seguir: 12- Homogeneizar bem e adicionar 15 µl das diluições do conjugado em cada poço, conforme esquema a seguir: LÂMINA 1 LÂMINA 2 Tubo 1 10 µl de Conjugado µl PBS-AE (dil. 1:100) Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 dil.1:200 dil.1:300 dil.1:400 dil.1:500 dil.1: µl PBS 200 µl PBS 300 µl PBS 400 µl PBS 500 µl PBS AE +100 µl AE +100 µl AE +100 µl AE +100 µl AE +100 µl dil 1:100 dil 1:100 dil 1:100 dil 1:100 dil 1: Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C, em estufa. 14- Lavar as lâminas, se possível com leve agitação rotacional, 3 vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 5 minutos cada lavagem, e em seguida lavar as lâminas uma vez em água destilada. 15- Colocar as lâminas por aproximadamente 10 minutos a 37 C, em estufa, para secagem. 16- Adicionar de 3 a 4 gotas de glicerina tamponada sobre cada lâmina, e cubrí-las com lamínulas. Mantê-las ao abrigo da luz e umidade, até o momento da leitura. 8 9 ATENÇÃO: evitar que a ponta da ponteira toque ou raspe a superfície da lâmina, pois este procedimento provocará a retirada dos parasitas. Tomar cuidado para que o conteúdo de diferentes poços não se misturem. Utilizar uma ponteira para cada controle a ser utilizado. 7- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos, à 37 C, em estufa. 8- Lavar as lâminas, se possível com leve agitação rotacional, 9- Secar as lâminas por 10 minutos a 37 C, em estufa. 10- Preparar uma solução de PBS-Azul de Evans (PBS-AE) a 0,04%, colocar em um tubo 120 µl de Azul de Evans e 2880 µl de PBS. 11- Diluir o conjugado anti-imunoglobulina (Ig) humana marcada com fl uoresceína em PBS-AE, conforme descrito a seguir: 12- Homogeneizar bem e adicionar 15 µl das diluições do conjugado em cada poço, conforme esquema a seguir: LÂMINA 1 LÂMINA 2 Tubo 1 10 µl de Conjugado µl PBS-AE (dil. 1:100) Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 dil.1:200 dil.1:300 dil.1:400 dil.1:500 dil.1: µl PBS 200 µl PBS 300 µl PBS 400 µl PBS 500 µl PBS AE +100 µl AE +100 µl AE +100 µl AE +100 µl AE +100 µl dil 1:100 dil 1:100 dil 1:100 dil 1:100 dil 1: Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C, em estufa. 14- Lavar as lâminas, se possível com leve agitação rotacional, 3 vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 5 minutos cada lavagem, e em seguida lavar as lâminas uma vez em água destilada. 15- Colocar as lâminas por aproximadamente 10 minutos a 37 C, em estufa, para secagem. 16- Adicionar de 3 a 4 gotas de glicerina tamponada sobre cada lâmina, e cubrí-las com lamínulas. Mantê-las ao abrigo da luz e umidade, até o momento da leitura.