Técnica Básicas para Análises de Células e Tecidos

Transcrição

1 Técnica Básicas para Análises de Células e Tecidos Visão panorâmica da célula Algumas grandezas... 1km 1.000m 1m 100 cm 1cm 10 mm 1mm 1000 µm 1 µm 1000 nm 1Å (Angstron Angstron) m Visão panorâmica da célula Aumento e Poder de Resolução Visão panorâmica da célula Resolução: menor distância para que duas partículas apareçam como objetos separados. O limite de resolução da Microscopia Óptica é de 0,2 µm Desenvolvimento da Microscopia -Microscópio Óptico (luz) -Microscópio Eletrônico (elétrons) Microscópio óptico utiliza feixes de luz Sistemas de lentes (condensador, objetiva e ocular) O limite de resolução do MO é de 0,2 µm e depende essencialmente da objetiva. 1

2 Microscópio óptico Microscópio óptico de campo claro Microscópio óptico de fluorescência Microscópio óptico de fluorescência Microscópio óptico confocal Outros tipos de microscópios ópticos Iluminação direta (sem coloração) Contraste de fase (refração da luz) Contraste diferencial de interferência (refração da luz) 2

3 Microscópio eletrônico -utiliza feixes de elétrons -lentes eletromagnéticas Alta resolução, abaixo de 0,3 nm. Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio Microscópio eletrônico de transmissão: Alta resolução Necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm) Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio Imagem elétron-densa (escura) e elétron-lúcida (clara) Estrutura e funcionamento Microscópio eletrônico de transmissão Microscópio eletrônico de varredura Alta resolução Fragmentos maiores ou tecidos inteiros Material biológico é recoberto com metais como ouro ou platina Estrutura tridimensional (3D) Microscópio eletrônico de varredura MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA Microscópio eletrônico de varredura 3

4 Centro de Microscopia Eletrônica UNESP - Botucatu MEV MET Preparação de material para análise ao microscópio As células e tecidos precisam estar perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando vivas. Fixação Preserva a morfologia e composição do tecido. Fixador mais utilizado Formaldeído. Para microscopia eletrônica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos especiais em soluções de aldeído glutárico e tetróxido de ósmio. Lavagem Desidratação Retirada da água presente nos tecidos através de sucessivos banhos em uma série de etanol (70% 80% 90% 100%). 4

5 Meio de impregnação Substituição do líquido (xilol) por parafina ou resina sintética. A resina sintética possibilita cortes mais finos (1 a 2 µm). O ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm) e por isso utiliza se resinas mais duras. Neste caso os cortes são feitos com navalhas de vidro ou diamante. Diafanização ou clareamento Substituição do etanol por líquido miscível (geralmente xilol) com o meio de impregnação e retirada de lipídios. Meio de inclusão Suporte para o tecido impregnado. Tecido preparado para análise ao Microscópio Eletrônico Micrótomo Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura). Micrótomo automatizado Permite a obtenção rápida de cortes sem passar pelas etapas descritas antes. 5

6 Micrótomo Realizando cortes do material Micrótomo Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura). Xilol Retirada da parafina Série alcoólica lica - Rehidratação. Estufa 60 o C Derreter e eliminar a parafina Hidratação completa Coloração A maioria dos corantes utilizados se comportam como ácido ou base. Estrutura celular basófila, liga-se a corantes básicos. Estrutura celular acidófila, liga-se a corantes ácidos. Corantes básicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina... Corantes ácidos: eosina, orange G, fucsina ácida... Coloração Hematoxilina/Eosina (HE) Coloração freqüentemente utilizada Além destes corantes freqüentemente utilizados, utiliza se também outros tipos de coloração, como a impregnação com sais de prata e ouro. 6

7 ...outras técnicas que podem ser empregadas na Biologia Celular e Molecular Além destas colorações frequentemente utilizadas, outros métodos baseados em reações químicas (citoquímica), imunológicas (imunocitoquímica), entre outras, também podem ser empregados. : Radioautografia : Imunocitoquímica : Cromatografia : Eletroforese : Cristalografia e difração de raio-x : Hibridação de ácidos nucléicos Montagem das lâminas Análise do Material Plano de corte Resultados 7