Observações Iniciais. Microscopia Aula Revisão. Observações Iniciais. Unidades de Medidas Usadas. Formação da Imagem. Unidades de Medidas Usadas

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1 Professor, Enfº. Laudineide de Carvalho Gomes Matipó, fevereiro de Faculdade Vértice Univértix Curso: Medicina Veterinária Aula Revisão Page 2 Observações Iniciais Simples - lupa; Composto Junção de dois sistemas de lentes convergentes. Invenção do microscópio é atribuída a Antoine von Leeuwenhoek e Robert Hooke no séc. XVII. Teorias de Schleiden e Schwann, no século XIX; Técnicas e metodologias citoquímicas. v Observações Iniciais Unidades de Medidas Usadas Estruturas micro e macroscópicas; São o micrômetro (µm) M. O.; Nanômetro (ηm) e o Angstrom (Å) M. E.; 1 µm = 10-3 mm (0,001 mm) = 10-6 m 1 ηm = 10-3 µm = 10-6 mm (0, mm) = 10-9 m 1 Å = 10-1 ηm = 10-4 µm = 10-7 mm (0, mm) = m Page 3 Page 4 Unidades de Medidas Usadas Formação da Imagem Em termos de formação de imagem é fundamental percebermos o significado de três conceitos muito importantes, que são o poder de ampliação, o poder de resolução e o limite de resolução. Page 5 Page 6 1

2 Formação da Imagem Poder de Ampliação Ampliada Simétrica Invertida Virtual objeto F F F Imagem I Imagem II C C C Capacidade de um aparelho aumentar n vezes uma imagem. Na microscopia é Fonte de luz condensadora objetiva ocular dado pelo produto entre a ampliação Fonte de luz Lente condensadora Lentes objetivas Lente ocular Page 7 O posicionamento estratégico das lentes no microscópio proporcionam a formação de uma imagem Invertida Page 8 das oculares e a ampliação das objetivas. Poder de Resoluação Limite de Resolução Capacidade de um aparelho fornecer imagens distintas de dois pontos. Refere-se à riqueza de detalhes da imagem obtida, ou seja, à Capacidade de individualização de estruturas (pontos); Inversamente proporcional ao limite de ampliação da imagem; Olho humano 0,1 mm; capacidade do microscópio fornecer imagens Page 9 nítidas, com detalhes estruturais. Page 10 Onde: K = uma constante experimental estimada em 0,61; λ = comprimento de onda da energia utilizada (luz ou feixes de elétrons) AN = abertura numérica da lente objetiva. Limite de Resolução Resolução é diretamente proporcional ao comprimento de onda; Redução do comprimento de onda (alteração da fonte luminosa) e/ou Limite de Resolução Relação de meio e lâmina índice de refração. Valores do índice de refração para diferentes meios aumento da abertura numérica; AN = 0,12 (4x) AN = 0,34 (10x) AN = 0,60 (40x) AN = acima de 1 (100x) Material Índice de Refração Ar Água 1.33 Glicerol 1.47 Óleo de imersão Vidro 1.52 Diamante 2.42 Page 11 Page 12 2

3 Noções de Profundidade de Campo Eletrônica Regiões do plano focal que permanecem em foco; Relação de profundidade de campo e abertura numérica; Devido à pequena profundidade de campo dessa objetiva, um reduzido número de planos de um objeto será focalizado simultaneamente; Maior profundidade de campo é obtida utilizando objetivas com menores aberturas numéricas, ou diminuindo-se a abertura dopage diafragma. 13 Page 14 Componentes Eletrônica Formação da imagem ao Microscópio eletrônico CANHÃO ELETRÔNICO = pequeno fragmento de fio onde se aplica alta voltagem. Emite elétrons por aquecimento. LENTES = bobina formada por milhares de voltas de fio, por onde passa uma corrente elétrica. Page 15 Fonte de elétrons Caminha por um sistema de lentes eletromagnéticas (coluna) Feixe de elétrons Acelerados Lente condensadora Amostra Lentes objetivas (primeira imagem aumentada da amostra) Lentes intermediarias / projetivas (formação final da imagem) Imagem ampliada Anteparo fluorescente/ monitor Page 16 Microscópio Eletrônico de Transmissão - MET Microscópio Eletrônico de Transmissão - MET Imagem formada simultaneamente à passagem do feixe de luz Os elétrons atravessam o espécime; Alguns dos elétrons são espalhados outros convergem para formar a imagem; Permite definição de imagens intracelulares; Intervalo de aumento: 1.000x a x; LR = 1nm. Page 17 Page 18 3

4 Microscópio Eletrônico de Varredura - MEV Microscópio Eletrônico de Varredura - MEV O feixe de elétrons varre o espécime; Imagem constituída em seqüência no tempo; Indispensável em pesquisas de: Taxonomia de insetos e fungos; Morfologia de polens e superfície de diversas estruturas de plantas e animais; Grande profundidade de campo: micrografias tridimensional; Escala de aumentos: 10x a x; LR = 10nm. Page 19 Page 20 MET x MEV MET x MEV O MET estudos em nível molecular, e estruturas subcelulares, é um instrumento complexo, os espécimes devem ser ultrafinos, informações em três dimensões dificultadas. O MEV estudo topográficos, pouca informações interna. Coloração negativa: vírus Tecido muscular Guelras de um peixe Cílio Células epiteliais Hepátócito: Complexo de Golgi Page 21 Page 22 Page 23 Serve para ampliar um objeto. Funciona com um conjunto de lentes (ocular e objetiva) que ampliam a imagem. A Iluminação é natural ou artificial. É constituído por uma parte mecânica que suporta e permite controlar uma parte óptica que Page 24 amplia as imagens. 4

5 Braço Pinças Parafuso macromético Parafuso micromético Ocular Canhão Revólver Objetivas Platina Condensador Diafragma Fonte luminosa Pé ou base Oculares Ampliam a imagem fornecida pelo sistema de objetivas. Page 25 Page 26 Canhão ou tubo Braço Serve de suporte ao sistema ocular. Serve de suporte à platina e ao revólver. Page 27 Page 28 Objectivas Revólver Page 29 Amplia a imagem do objeto que está a ser observado. Page 30 Serve de suporte às objetivas e permite a sua mudança 5

6 Platina Condensador Page 31 Serve de suporte à preparação a observar. Tem uma abertura na pane central (janela da platina). Page 32 Distribui regularmente no campo da preparação a luz que atravessa o diafragma Diafragma Fonte de Luz Page 33 Regula a intensidade da luz captada pelo espelho e que incide na preparação. Page 34 Parafusos Macrométrico e Micrométrico Base ou pé Page 35 Permite movimentos (de maior ou menor amplitude) de aproximação ou afastamento entre a preparação e as objetivas. Page 36 Constitui a base de suporte de todos os elementos do microscópio. 6

7 Observações ao Microscópio Diferenças básicas entre o M. O. e M. E Page 37 Diatomáceas Ameba Volvox Ovo em desenvolvimento Protozoários Raiz de um cabelo Page 38 Fonte Luminosa Lentes Visualização Material MO Luz visível (fótons) Ópticas (cristal) Direta Fresco ou fixado ME Feixes de elétrons Bobinas (Eletromagnéticas) Tela de computador Fixado Coloração do Material Esfregaço Montagem total: células inteiras (órgãos de insetos, glândulas salivares); Esfregaço: camada de material líquido sobre a lâmina (sangue, sêmen); Espalhamento: raspagem de camadas superficiais de mucosas (papanicolau); Esmagamento: estudo de divisões celulares; Decalque: colocar sobre a lâmina núcleos inteiros. Estudar DNA. Page 39 Page 40 Esmagamento Fixação Preservar a célula: coagulação; Impede autólise e proliferação de bactérias; Page 41 Agentes fixadores: formol, álcool etílico, álcool acético. Page 42 7

8 Inclusão e Corte Coloração Corte de órgãos e tecidos: obter material transparente. Aparelho para corte: micrótomo (MO) ou ultra-micrótomo (ME). Inclusão: tornar o material apropriado para o corte solidificado. Tornar visíveis os diversos componentes da célula; Corantes básicos: carga positiva; Afinidade por grupamentos ácidos (cargas negativas) das moléculas: DNA, RNA, algumas proteínas; Page 43 Substâncias para inclusão: parafina (MO) ou epóxi (ME). Page 44 Ex corantes básicos: hematoxilina, azul de metileno. Coloração Montagem Corantes ácidos: carga negativa; Afinidade por grupamentos básicos (carga positiva) das moléculas: proteínas citoplasmáticas; Ex: corantes ácidos: eosina, fucsina ácida. Fechar o material entre a lâmina e a lamínula. Resina solidificável: aumentar transparência e conservá-los. Ex: bálsamo-do-canadá (n = 1,535). Page 45 Page 46 Exame a Fresco Exame a Fresco Observação ao microscópio de células, pequenos organismos vivos ou fragmentos de tecidos vivos ; Líquidos naturais: água doce, água do mar, soro sanguíneo, etc...; Líquidos artificiais: soro fisiológico; Vantagem:contraprova, rápido, simples; Constitui um procedimento intermediário entre a observação a fresco e a observação após a fixação. Uso de corantes não tóxicos: Corantes vitais: azul de metileno vermelho neutro Restrições: objetos finos e transparentes; observações rápidas. Page 47 Page 48 verde Janus 8

9 Referências Básicas ALBERT, B. JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; BOBERTS, K.; WALTER, P. Biologia Molecular da Célula. 4 ed. Porto Alegre: Artmed, p. ALBERTS, B.; BRAY, D.; HOPKING, K.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P. Fundamentos da Biologia Celular. 2. ed., Porto Alegre: Artmed, p. JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. 8. ed., Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, P. JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 7ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, Page 49 9