20/8/2012. Raduan. Raduan

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1 MÉTODOS DE ESTUDO: CÉLULAS E TECIDOS 1

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4 Etapas na preparação de amostras de tecidos para estudo histológico 4

5 Fixação Finalidades: Evitar a autólise; Impedir a atividade e proliferação de bactérias; Endurecer as células resistir as próximas etapas; afinidade das estruturas celulares pelos corantes usados na M.O. e contrastes na M.E. Preservar a morfologia e composição dos tecidos. Fixação Agentes Fixadores: Físicos: Frio (Congelação); Calor Químicos Formaldeído (+comum); Aldeído glutárico Tetróxido de ósmio Microscopia eletrônica Misturas fixadoras (Bouin,etc) Inclusão Incluídos (protegidos) em parafina ou resina plástica M.O. Incluídos em resinas do tipo epóxi (Araldite, Epon) M.E. OBS.: Envolvem e penetram nas células. 5

6 Inclusão OBS.: Antes da inclusão a amostra sofre: Desidratação ([ ] etanol = 70% Absoluto) Diafanização (clareamento = benzol, xilol ou toluol) Microtomia Micrótomo Microscopia óptica: cortes de 1 a 6 µm, geralmente; Microscopia eletrônica: cortes de 0,02 a 0,1 µm, geralmente; Micrótomo de congelação (obtenção rápida de cortes, histoquímica, etc). Coloração A maioria dos tecidos é incolor; Facilita a visualização dos componentes teciduais; Propicia contraste entre os componentes celulares; 6

7 Corantes básicos O grupamento químico responsável pela cor (cromóforo) = catiônico Combinam-se com grupamentos ácidos (aniônicos) das moléculas celulares. Ex.: DNA, RNA (Basófilas = afinidade por corantes básicos) Corantes básicos Azul de toluidina Azul de metileno Hematoxilina Corantes ácidos Cromóforo = aniônico Combinam-se com grupamentos básicos (catiônicos) das moléculas celulares. Ex.: Componentes básicos das proteínas citoplasmáticas (acidófilas = afinidade por corantes ácidos). 7

8 Corantes ácidos Orange G Fucsina ácida Eosina HEMATOXILINA & EOSINA (H&E) Coloração dupla + utilizada na rotina histológica; Hematoxilina: cora em azul os núcleos celulares e estruturas de natureza ácida (basófilas); Eosina: cora em diversas tonalidades de vermelho o citoplasma e o colágeno do material extracelular (acidófilas). MICROSCÓPIOS 8

9 Microscópio óptico Parte mecânica Suporte para a parte óptica Parte óptica Condensador Objetiva Ocular Microscópio óptico Microscópio óptico Ampliação total da imagem = Aumento da objetiva x Aumento da ocular 9

10 Microscópio óptico Poder de resolução (sistema óptico) = capacidade de separar detalhes Microscópio óptico Limite de resolução = menor distância que deve existir entre 2 pontos para que eles apareçam, individualizados. Ex.: 2 partículas separadas por 0,3 µm aparecem individualizadas em um sistema óptico com limite resolutivo de 0,2 µm, porém aparecem como partícula única quando o limite resolutivo é de 0,5 µm Microscópio óptico Limite de resolução (LR) LR = K x λ AN K = constante de valor 0,61; AN = abertura numérica (AN= n x sen α; n=índice de refração; α= semiângulo da abertura) 10

11 Microscópio óptico O que determina a riqueza de detalhes da imagem formada por um sistema óptico é o seu limite de resolução, e não o seu poder de aumentar o tamanho dos objetos. Microscópio de Contraste de fase Transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade; Traduzida de fase de intensidade luminosa = perceptível Microscópio de Contraste de fase Utilizado no estudo de células e tecidos vivos; Estruturas celulares Escuras = fase positiva Claras = fase negativa 11

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13 Microscópio Confocal A iluminação é feita por um delgado feixe de raios laser, que varre ponto por ponto um determinado plano da célula = corte óptico ; A imagem é formada exclusivamente pelas estruturas que estão no plano de varredura imagem muito nítida. 13

14 Microscópio de fluorescência Utiliza fonte de luz ultravioleta; Luz UV espécime Luz visível Estruturas marcadas com corantes fluorescentes Ex.:Alaranjado de acridina (DNA verde-amarelado; RNA vermelho-alaranjado) Citoesqueleto (cultura de fibroblastos) M. eletrônica Citoesqueleto (cultura de fibroblastos) RITC-phalloidin M. fluorescência 14

15 Microscópio eletrônico Apresenta alta resolução; Riqueza de detalhes; Utiliza feixes de elétrons; Cortes ultra-finos (20 a 100 nm) Microscópio eletrônico Transmissão Aquecimento do cátodo (filamento de tungstênio) no vácuo = elétrons acelerados por uma de potencial de 60 a 100 kv placa perfurada feixes de elétrons lentes eletromagnéticas (condensadora) objeto lentes ( objetiva) lente (projetora) tela fluorescente ou filme fotográfico Microscópio eletrônico de transmissão 15

16 Microscópio eletrônico Varredura Bobina de varredura feixe de elétrons incide ponto por ponto do objeto Microscópio eletrônico de varredura HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA 16

17 HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA Métodos utilizados para a localização intracelular das diversas substâncias que compõem as células e tecidos. HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA Reações químicas específicas, ou interação macromolecular de alta afinidade compostos insolúveis, corados, ou elétrondensos localização de substâncias específicas (M.O. ou M. E.) HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA Lipídios Corantes + solúveis nos lipídios do que no líquido que o corante está dissolvido; Sudan IV vermelho Sudan negro preto 17

18 HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA Ácido desoxirribonucléico (DNA) Reação de Feulgen Hidrólise do DNA (ácido clorídrico) DNA com radicais aldeído livres + reativo de Schiff composto insolúvel e vermelho *Intensidade da cor proporcional ao teor de DNA HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA Ácido ribonucléico (RNA) Afinidade por corantes básicos (azul de toluidina ou azul de metileno); Ribonuclease Utiliza-se 2 preparações HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA Polissacarídeos Glicogênio P.A.S. (Periodic Acid-Schiff) Amilase Utiliza-se 2 preparações 18

19 IMUNOCITOQUÍMICA Direta Anticorpo marcado (peroxidase, ferritina, etc) Indireta Antianticorpo marcado (peroxidase, ferritina, etc) 19