VISITA DIRIGIDA AO LABORATÓRIO DE HISTOTECNOLOGIA

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Diogo Fidalgo Fonseca
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1 VISITA DIRIGIDA AO LABORATÓRIO DE HISTOTECNOLOGIA MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS 01- COLHEITA DE MATERIAL Fragmentos de órgãos e tecidos a serem processados devem ser obtidos imediatamente após a morte do animal ou através de cirurgia a fim de evitar autólise. 02- FIXAÇÃO Consiste na preservação dos tecidos de modo que suas estruturas se mantenham normais e muito próximas do natural (in vivo). A fixação pode ser feita por agentes físicos como o calor ou por meio químicos. A Fixadores Simples: formol, álcool etílico e metílico, ácido pícrico, ácido acético, ácido crômico, bicromato de potássio etc. Misturas fixadoras: Líquido de Zenker = mistura bicloreto de mercúrio bicromato de potássio Líquido de Fleming = mistura crômio-ósmio-acética Líquido de Bouin = mistura picro-formol-acética Líquido de Helly = mistura bicloreto-bicromato-formol B Características de um bom fixador Rapidez de atuação; poder de penetração; conservação tanto quanto possível das estruturas existentes in vivo ; possibilitar o emprego subsequente de técnicas adequadas ao estudo das estruturas. C Prática de fixação Volume de fixador: mais de 30 vezes o volume da peça. Tempo de fixação: variável de acordo com o tamanho da peça, constituição de tecido, poder de penetração do fixador, objetivos e temperaturas de fixação. Tratamento subsequente do tecido: variável de acordo com fixador empregado. Medicina FAMERP

02- FIXAÇÃO Consiste na preservação dos tecidos de modo que suas estruturas se mantenham normais e muito próximas do natural (in vivo).

2 03 INCLUSÃO Consiste em uma série de processos visando a feitura do bloco. As substâncias utilizadas na inclusão são: parafina, celoidina, neve carbônica (congelamento), etc. ETAPAS DE INCLUSÃO EM PARAFINA (M.L.) Desidratação: É feita passando-se o material em concentrações crescentes de álcool de 50% até o absoluto. Clarificação (Diafanização): Nesta etapa o material é mergulhado em substâncias solventes da parafina como por exemplo: xilol, toluol, benzol, etc. Penetração pela parafina: O tecido é mergulhado em parafina fundida na estufa permanecendo aí por tempo variável a fim de ser impregnado pela parafina. Inclusão definitiva. 04 MICROTOMIA Tem por objetivo reduzir os tecidos a cortes finíssimos, transparentes ao microscópio. Os cortes são realizados em aparelhos especiais chamados micrótomos, dos quais existem modelos para inclusão em parafina, celoidina e congelação. Os cortes mais utilizados são de três a oito micrômetros de espessura. Cortes por congelação são vantajosos nas biópsias cirúrgicas para determinar a natureza benigna ou maligna de uma lesão, enquanto o paciente é mantido na mesa cirúrgica. CLASSIFICAÇÃO DOS CORANTES Os corantes podem ser classificados: 1 Quanto a origem a) corantes naturais: de origem animal ou vegetal. Animal: Carmim obtido do ovário de um hemíptero Cochonilha. Vegetal: Hematoxilina obtido da leguminosa pau-campeche. b) corantes artificiais: compostos aromáticos derivados da hulha denominada anilina. Ex. eosina, azul de metileno, fucsina, etc. Enfermagem FAMERP

Clarificação (Diafanização): Nesta etapa o material é mergulhado em substâncias solventes da parafina como por exemplo: xilol, toluol, benzol, etc.

3 2 Quanto a característica química a) Corantes ácidos: são os ácidos corantes e seus sais. Os sais resultam da combinação de corante ácido com uma base não corante. Estruturas ricas em grupamentos básicos são acidófilas, por terem afinidade pelo corante ácidos. Ex. eosina é o eosinato de sódio ou potássio (cora principalmente os componentes básicos das proteínas citoplasmáticas) b) Corantes básicos: são as bases corantes e seus sais em que a parte básica é uma base corante. Moléculas ácidas DNA e RNA são basófilas, isto é, tem afinidade pelos corantes básicos. Ex. azul de metileno (é o cloreto da base de azul de metileno), Hematoxilina (cora componentes ácidos das células). c) Corantes neutros: são os que resultam da reação entre um corante ácido e um corante básico. Ex. cloridrato de metileno mais eosinato de sódio = eosinato de azul de metileno (corante neutro) mais cloreto de sódio. d) Corantes indiferentes: são corantes insolúveis em água e solúvel em lipídeos. Ex. Sudan III e Sudam IV. 3 Quanto ao emprego: a) Corantes citológicos: são os que coram estruturas celulares como mitocôndrias, aparelho de Golgi, grânulos de secreção etc. Ex. verde Janus cora mitocôndrias. b) Corantes histológicos: são os que revelam elementos do tecido. Ex. orceína cora fibras elásticas 4 Quanto ao modo de ação: a) corantes eletivos: são aqueles corantes que coram especificamente os constituíntes do tecido e da célula. Ex. o Sudan cora seletivamente as gorduras. b) corantes difusos: não permite a diferenciação, corando homogeneamente. Ex. eosina. Enfermagem FAMERP

eosina é o eosinato de sódio ou potássio (cora principalmente os componentes básicos das proteínas citoplasmáticas) b) Corantes básicos: são as bases corantes e seus sais em que a parte básica é uma

4 CLASSIFICAÇÃO DAS COLORAÇÕES 1 Quanto ao número de cores a) Coloração monocrômica: uma só cor é dada a estrutura. Ex. corando-se um corte histológico pela eosina, todas as estruturas tornam-se róseas. b) Coloração bicrômica: são as colorações obtidas com duas cores diferentes. Ex. Hematoxilina/Eosina tinge o núcleo da célula de roxo e o citoplasma de rosa. c) Coloração tricrômica: cora o tecido em três cores fundamentais. Ex. Tricrômico de Gomori usa a Hematoxilina, cromotrope 2r e o Fast- Green corando o núcleo de roxo, citoplasma de vermelho e o tecido conjuntivo de verde. 2 Quanto ao número de corantes a) Coloração simples: Utiliza um só corante, específico para determinadas estruturas. Ex. Azul de metileno. b) Coloração combinada: Utiliza a combinação de vários corantes. Ex. Giemsa. 3 Quanto ao método de coloração a) Coloração progressiva: é a que se pratica sob controle do microscópio até a obtenção do tom desejado. b) Coloração regressiva: Faz-se uma super coloração e uma diferenciação (retirada do excesso de corante) com álcool ou ácido diluído. 4 Quanto ao modo de ação a) Coloração direta (ou substantiva): é quando ocorre afinidade direta entre a estrutura e o corante. b) Coloração indireta (ou subjetiva): quando não há afinidade direta entre a estrutura e o corante. Neste caso usa-se um mordente que é substância que prepara o tecido para reter o corante, agindo por precipitação das albuminas. Muitos mordentes neutralizam a ação redutora dos tecidos que impediria a colocação. Ex: alúmen, iodo, permanganato de potássio, etc. Enfermagem FAMERP

c) Coloração tricrômica: cora o tecido em três cores fundamentais. Ex.

5 COLORAÇÃO PELA HEMATOXILINA-EOSINA (H/E) 1 DESPARAFINAR: passam-se os cortes em dois banhos de sucessivos, de uma substância solvente da parafina (XILOL). 2 HIDRATAÇÂO: é feita gradativamente, usando-se concentrações decrescentes de álcool etílico na seguinte origem: álcool absoluto, álcool a 90%, álcool a 70% e finalmente água. 3 CORAR PELA HEMATOXILINA: o tempo de coloração varia de 4 a 5 minutos. 4 DIFERENCIAR: passar os cortes em solução de álcool-ácido e deixar azular em água. 5 CORAR PELA EOSINA: deixar os cortes no corante de 1 a 2 minutos. 6 DESIDRATAR: levar os cortes em concentrações sucessivas e crescentes de álcool a 95%, ABSI, ABSII. 7 CLARIFICAR: passar os cortes em três banhos de xilol. 8 Montar lamínula com Bálsamo-do-Canadá ou verniz. 9 Observar ao microscópio: núcleos em roxo e citoplasma em rosa. Enfermagem FAMERP

3 CORAR PELA HEMATOXILINA: o tempo de coloração varia de 4 a 5 minutos. 4 DIFERENCIAR: passar os cortes em solução de álcool-ácido e deixar azular em água.

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