UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB LABORATÓRIO MULTIUSUÁRIO DE ESTUDOS EM BIOLOGIA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB LABORATÓRIO MULTIUSUÁRIO DE ESTUDOS EM BIOLOGIA PROTOCOLO PADRÃO DE TÉCNICAS HISTOLÓGICAS VEGETAL PARA MICROSCOPIA DE LUZ REVISADO EM 08/06/2017 GERAL: 1 - Coleta e Dissecação 2 - Fixação 3 - Processamento (desidratação, diafanização e inclusão em parafina) 4 - Emblocamento 5 - Microtomia 6 - Coloração 7 - Montagem das Lâminas com Resina PASSO A PASSO: 1) COLETA E DISSECAÇÃO Se a amostra for muito grande deve-se fazer a macrotomia deste antes; Colocar as secções em cassetes e identifica-las a lápis. 2) FIXAÇÃO FIXADORES: Dependendo do tipo de análise deve-se optar por um fixador específico, por exemplo, para análise em microscopia de fluorescência, é muito utilizado o paraformaldeído tamponado. Neste caso não se deve utilizar o glutaraldeído, pois este gera autofluorescência. Para microscopia de luz branca o glutaraldeído é um ótimo fixador, mas pode-se utilizar também o paraformaldeído. A formalina tamponada também é utilizada para microscopia de luz branca, mas para uma análise histológica mais geral, não é indicada para análises mais detalhadas; O volume do fixador deve ser em torno de 20x o volume das amostras. PARAFORMALDEÍDO 4% TAMPONADO PH 7,2: Preparo: PFA (Paraformaldeído) g Água destilada ml PBS 0,2M ml Hidróxido de Sódio... 2 pedrinhas ou 3 gotas (1N) Aquecer a água destilada até 70 C, no misturador, colocar o imã (bailarina) e liga-lo, acrescentando aos poucos o PFA; Jogar duas pedrinhas ou mais de hidróxido de sódio ou de 3 a 5 gotas de hidróxido de sódio 1N até a mistura ficar clara e homogênea (transparente);

2 Por último, acrescentar a solução de PB 0,2M; Medir o ph (ph ~ 7,2) e filtrar a solução. O material deve permanecer no fixador de 12-24h; Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, ph 7,2 (30 minutos) e em seguida em H 2 O destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação. ou FORMALINA NEUTRA TAMPONADA PH 7,2: Formol 37% ml Água destilada ml Fosfato de Sódio Monobásico (1H 2 O)... 4,0 gramas Fosfato de Sódio Dibásico (7H 2 O)... 12,2 gramas Formol 37% ml Água destilada ml Fosfato de Sódio Monobásico (Anidro)... 4,0 gramas Fosfato de Sódio Dibásico (Anidro)... 6,5 gramas O material deve permanecer no fixador por aproximadamente 24h; Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, ph 7,2 (30 minutos) e em seguida em H 2 O destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação. GLUTARALDEÍDO 2,5% TAMPONADO PH 7,2: Glutaraldeído 25%... 5mL Tampão Fosfato de Sódio 0,1M... 45mL O material deve permanecer no fixador de 4-24h; O Glutaraldeído não deve ser usado para testes imunohistoquímicos; Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, ph 7,2 (30 minutos) e em seguida em H 2 O destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação. Solução Tampão Fosfato de Sódio (PBS - 0,2M) Água destilada... 1 L Fosfato de Sódio dibásico anidro... 11g Fosfato de Sódio monobásico monohidratado...2,75g Solução Tampão Fosfato de Sódio (PBS - 0,1M) Água destilada... 1 L Tampão PBS 0,2M... 1 L

3 3) PROCESSAMENTO Esta etapa consiste na impregnação do tecido por uma substância de consistência firme que permita, posteriormente, a realização de secções finas (5 a 10 µm) Devido ao preço, fácil manuseio e bons resultados, a parafina é a mais utilizada neste procedimento; Como a parafina não é miscível em água, a primeira etapa da inclusão compreende a desidratação das amostras, quando ocorre então a retirada da água dos tecidos através da substituição por álcool etílico; A diafanização é a etapa seguinte, com a substituição do álcool, agora presente nos tecidos, por xilol, solvente que é ao mesmo tempo miscível em álcool e parafina; Finalmente, na impregnação, última etapa, o xilol é substituído por parafina fundida a 60. 1ª DESIDRATAÇÃO Sequência: Álcool etílico 30 % 2 horas Álcool etílico 50 % 2 horas Álcool etílico 70 % 2 horas Álcool etílico 80 % 2 horas Álcool etílico 90 % 2 horas Álcool etílico 100 % I 2 horas Álcool etílico 100 % II 2 horas A amostra pode ser conservada no álcool 70% por alguns dias. 2º DIAFANIZAÇÃO Seqüência: 1º Xilol I (50% de Álcool100% e 50% de Xilol) 1 hora 2º Xilol II (Puro) 1 hora Conseqüências: O tecido torna-se transparente. Retira a gordura dos tecidos. A ausência de turvação indica boa desidratação. Os tecidos não podem ficar muito tempo no Xilol. O Xilol é hidrofóbico, por isso os órgãos inicialmente ficam mergulhados no álcool. Usa-se o Xilol para retirar o álcool, pois este não é miscível em parafina. 3º INCLUSÃO NA PARAFINA Parafina I 6 horas Parafina II 6 horas Parafina III 6 horas A partir da etapa do álcool 70%, O LAMEB disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Processador de Amostras Leica TP1020.

4 4) EMBOCAMENTO Colocar a parafina no molde de metal e então colocar a amostra de acordo com o corte que pretendemos realizar (longitudinal, transversal...); Após os blocos estarem duros (esperar pelo menos 24 horas). O ideal é colocar na geladeira por algumas horas para só depois utilizá-los no micrótomo. Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Emblocador de Amostras Leica EG1150H. 05) MICROTOMIA Fazer as secções de 5 a 10 micrômetros utilizando um micrótomo rotativo; Pegar a fita e colocar em água aquecida com gelatina a aproximadamente 45 C, pegar as secções com a lâmina. Solução para distender as secções no banho-maria Gelatina em pó incolor... 4 gramas Água aquecida (55ºC)... 2 litros Antes da coloração, colocar previamente as lâminas em estufa entre 40 C e 55 C, ideal 50 C, ou placa aquecida para derretimento da parafina, por aproximadamente 1 hora. Isto ajuda a fixar o corte na lâmina. Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Micrótomo Rotativo Leica RM2255.

5 06) COLORAÇÃO Nesta etapa ocorre a desparafinização (retirada da parafina) dos cortes na lâmina, em seguida a hidratação para então corar o tecido. COLORAÇÃO COM AZUL DE ASTRA (3%) E FUCSINA BÁSICA (0,06%) Esta citoquímica é realizada de acordo com o método de Kraus et al. (1998), com modificações. Artigo: KRAUS, J.e.; SOUSA, H.C.; REZENDE, M.H.; CASTRO, n.m.; VECCHI, C. & LUQUE Astra Blue and Basic Fuchsin Double Staining of Plant Materials. Biotechnic & Histochemistry: Aplicação: Coloração de parede primária (celulose) com o Azul de Astra e parede secundária (Lignina e suberina) com Fucsina Básica. Possibilidades de uso: Material sem inclusão (fresco ou fixado) ou incluído (metacrilato ou parafina). Resultado: Parede primária cora em azul e paredes secundárias em rosa avermelhado. Reagentes: Azul de Astra a 1% Azul de Astra... 1,0g Água destilada, completar até ,0 ml Fucsina básica 0,06% Fucsina Básica... 0,06g Água destilada, completar até ,0 ml Sequência de Coloração: 1º - Xilol Puro I (desparafinização) 10 minutos 2º - Xilol Puro II (desparafinização) 10 minutos 3º - Álcool 100 % I (hidratação) 5 minutos 4º - Álcool 100% II (hidratação) 5 minutos 5º - Álcool 90% (hidratação) 5 minutos 6º - Álcool 80% (hidratação) 5 minutos 7º - Álcool 70% (hidratação) 5 minutos 8º - Álcool 50% (hidratação) 5 minutos 9º - Água (hidratação) 10 minutos 10º - Azul de Astra (coloração) 1 hora 11º - Água Corrente (lavagem) 3 minutos 12º - Fucsina Básica (coloração) 3 minutos 13º - Água Corrente (lavagem) 3 minutos 14º - Álcool 70% (desidratação) 3 minutos 15º - Álcool absoluto I (desidratação) 3 minutos 16º - Álcool Absoluto II (desidratação) 5 minutos 17º - Xilol I (50% de Álcool100% e 50% de Xilol) 5 minutos 18º - Xilol II Puro (Fixação do corante e conservação do material) 10 minutos Na última etapa (Xilol II) pode ficar mais que 10 minutos.

6 COLORAÇÃO ATO (AZUL DE TOLUIDINA) Esta citoquímica é realizada de acordo com o método de Gordon e McCandless (1973), com modificações. Artigo: GORDON, E. M.; MCCANDLESS, E. L. Ultrastructure and histochemistry of Chondrus crispus Stack. Proceedings of Nova Scotia Institute of Science, v. 27, p , Aplicação: Reação com grupos ácidos de componentes teciduais (radicais carboxílicos, sulfatos e fosfatos). Significado químico do corante altera-se em função do ph. ph neutro a 4,0 3 radicais mostram-se corados. ph 3,5 apenas os grupamentos sulfato e fosfatos. ph 1,0 somente os sulfatos. Possibilidades de uso: material sem inclusão (fresco ou fixado) ou incluído (metacrilato ou parafina). Resultado: o azul de toluidina é um corante metacromático, que exibe coloração diferente de acordo com o substrato que reage. Pectinas coram de roxo e paredes lignificadas e fenólicos não estruturais coram de verde ou azul esverdeado. Reagentes: Solução de Azul de Toluidina: - ph 7: 0,5g de Azul de Toluidina ml de água destilada (pode ser também tampão fosfato de sódio 0,1M - ph 6,5). - Diluir o corante na água e depois filtrar com papel filtro. - ph 3 ou 4: Colocar HCl (1N) até adquirir o ph desejado. Ácido Clorídrico 1N: 8ml de Ácido Clorídrico P.A ml de água destilada. OBS: Coloca-se sempre o ácido na água e nunca o contrário. Sequência de Coloração: 1º - Xilol Puro I (desparafinização) 10 minutos 2º - Xilol Puro II (desparafinização) 10 minutos 3º - Álcool 100 % I (hidratação) 5 minutos 4º - Álcool 100% II (hidratação) 5 minutos 5º - Álcool 90% (hidratação) 5 minutos 6º - Álcool 80% (hidratação) 5 minutos 7º - Álcool 70% (hidratação) 5 minutos 8º - Álcool 50% (hidratação) 5 minutos 9º - Água (hidratação) 10 minutos 10º - ATO (coloração) 2 minutos 11º - Água Corrente (lavagem) 1 minuto 12º - Álcool 70% (desidratação) 1 minuto 13º - Álcool absoluto I (desidratação) 2 minutos 14º - Álcool Absoluto II (desidratação) 3 minutos 15º - Xilol I (50% de Álcool100% e 50% de Xilol) 5 minutos 16º - Xilol II Puro (Fixação do corante e conservação do material) 10 minutos Na última etapa (Xilol II) pode ficar mais que 10 minutos.

7 Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Sistema de Coloração de Lâminas Leica AutoStainer XL. MONTAGEM DA LÂMINA COM LAMÍNULA Sequência: 1º - Pingar 2 gotas de resina líquida (Entelan, Permount, Bálsamo do Canadá...); 2º - Colocar a lamínula sobre a lâmina; 3º - Pressionar levemente para tirar as bolhas; 4º - Levar as lâminas até a estufa para secagem ou deixar secando ao ar livre; 5º - etiquetar as lâminas. Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Aplicador de Lamínulas Leica CV5030.