COLORAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS ESPECIAIS

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1 COLORAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS ESPECIAIS As preparações histopatológicas envolvem etapas de coloração cujo propósito baseia-se em permitir a distinção morfológica do material celular presente na amostra. Esta etapa é considerada fundamental porque promove a diferenciação das estruturas que apresentam o mesmo grau de refringência durante a avaliação realizada por microscopia óptica. Os corantes podem ser classificados de acordo com a origem de sua matéria prima em naturais (de origem animal ou vegetal) e artificiais (compostos orgânicos da série aromática). Em relação à natureza química, os corantes classificam-se em ácidos, básicos e neutros. Os corantes básicos, derivados do composto anilina, são sais cujos radicais são alcalinos. Por este motivo, são capazes de corar os tecidos com ph ácido, também conhecidos como basofílicos, como por exemplo os ácidos nucléicos (DNA e RNA), polissacarídeos sulfurosos, polissacarídeos dos ácidos urônico e siálico, e proteínas que contêm mais radicais do grupo carboxílico do que do grupo amino. Alguns sais que apresentam predomínio de ânions (sulfonato ácido de Na e K ou um ácido carboxílico) podem ser utilizados como corantes ácidos. Estes sais possuem a capacidade de corar os tecidos de natureza alcalina que são constituídos, na sua maior parte, por proteínas que contêm excesso de aminoácidos alcalinos, como por exemplo a arginina, a lisina, a hidroxilisina e a histidina. Um exemplo de corante neutro é o picrato do azul de metileno. Neste tipo de corante o ânion e o cátion encontram-se corado. Há ainda os corantes descritos como indiferentes. Estas substâncias não são ácidas nem básicas, e tão pouco possuem a capacidade de formar sais. Normalmente estas substâncias são insolúveis na água e solúveis no álcool, éter e óleos. Exemplo: Sudan III. Figura 1.Canino, fibroleimioma uterino. Coloração especial de Tricrômio de Masson. Tecido conjuntivo abundante (azul) em mais de 50% das células neoplásicas. Obj. 40x. Fonte: /Poster_12326 Figura 2. Canino, fibroma uterino. Imuno-histoquímica antivimentina com marcação citoplasmática acentuada, complexo estreptovidina- biotina-peroxidase, cromógeno DAB e contracoloração com Hematoxilina de Harris. Fonte: /Poster_12326

2 HEMATOXILINA A hematoxilina é considerada um corante nuclear, cuja substância ativa é a hemateína. A hemateína necessita de um mordente para que a durabilidade da cor seja assegurada. Esta mistura forma um sal que é capaz de corar os tecidos. A base utilizada como mordente pode ser o alumínio ou então um sal de cobre, de ferro, de cromo ou de tungstênio. Todas estas bases reproduzem excelente coloração nuclear. A hematoxilina e a hemateína são solúveis no álcool e na glicerina. Ao contrário da hematoxilina, a hemateína é pouco solúvel na água. Ao utilizar a hematoxilina para realizar a coloração nuclear na amostra, existem duas opções de métodos para se alcançar a nitidez nuclear ideal. O método regressivo (Ex: Aquele que utiliza a hematoxilina de Harris) consiste em corar todas as estruturas tissulares concomitantemente e após essa etapa realizar uma descoloração controlada até atingir a coloração nuclear desejada. No método progressivo (Ex: Aquele que utiliza a hematoxilina de Mayer) apenas os núcleos são submetidos à coloração proveniente da hemateína e a intensidade de azul é regulada através de lavagens sucessivas em água corrente. EOSINA As eosinas são sais de sódio ou de potássio derivados da bromofluoresceína. Sua exata coloração está relacionada com o número de átomos de bromo fixados à fluoresceína. As eosinas utilizadas nas coloraçõres histológicas são solúveis em água e álcool. Sua característica tintorial é normalmente difusa apresentando uma amplitude relativamente larga de tons de rosa. Entretanto é a eosina amarela em solução aquosa a 2% a mais utilizada nas colorações em conjunto com a hematoxilina. O tempo de coloração pode variar de 1 a 7 minutos e depende do tecido a ser corado e do grau de diferenciação desejado para a amostra em questão. PERIODIC ACID-SCHIFF (PAS) Esta técnica é considerada muito útil, pois confere uma reação positiva com todo material constituído por polissacarídeos complexos, incluindo o glicogênio, o ácido hialurônico, as mucoproteínas e glicoproteínas, os glicolipídeos e os fosfatídeos. Desta forma, esta coloração permite a identificação ou detecção de glicogênio, mucinas neutras e membranas basais presentes em tecidos de origem glandular, além de evidenciar a maior parte dos fungos e parasitas. As substâncias, estruturas ou microrganismos positivos para o PAS apresentam-se coradas de vermelho a rosa. COLORAÇÃO DAS FIBRAS DO TECIDO CONJUNTIVO Estas colorações, chamadas de tricrômicas, possuem a finalidade de evidenciar o músculo, as fibras de colágeno, a fibrina e os eritrócitos. Com a finalidade de se corar o núcleo, 3 corantes são utilizados. No método de Van Gieson, um dos mais antigos, os núcleos aparecem azuis escuros a pretos, a cartilagem azulada, as fibras de colágeno e as membranas basais de vermelho e os outros tecidos aparecem tingidos de amarelo. Existem algumas colorações para demonstração dos tecidos conjuntivos, a maioria cai na categoria das colorações tricrômicas. O termo coloração tricrômica é o nome geral para técnicas que evidenciam o músculo, fibras de colágeno, fibrina e eritrócitos. São utilizados três (3) corantes um dos quais é usado como corante nuclear. Uma das colorações mais antigas é o método de van Gieson, com a qual os núcleos ficam azuis escuros a pretos, cartilagem azulada, o colágeno vermelho (fibras de colágeno e membranas basais) e os outros tecidos amarelos (fibras elásticas, citoplasma das células epiteliais e musculares).

3 Outra coloração tricrômica muito utilizada é a coloração de Masson. Com esta técnica, os núcleos ficam azuis escuros ou pretos, o músculo, os eritrócitos e o citoplasma das células tornam-se vermelhos e o colágeno, azul. COLORAÇÕES ARGENTAFINS E ARGIROFÍLICAS A reação argentafim ocorre quando existem substâncias no tecido alvo, frequentemente provenientes do grupo fenólico (Ex: catecolaminas ou indolaminas), que reduzem os sais de prata (e outros metais) Fontana-Masson. Nas reações argirofilicas é adicionado um agente redutor externo tal como a hidroquinona ou a formalina Grimelius. Nos dois tipos de colorações obtêm-se grânulos castanhos escuros ou negros. Para os demais tecidos a cor obtida dependerá do corante de contraste utilizado. Estas colorações são utilizadas para detectar células de origem neuroendócrina e melanina. COLORAÇÃO DA SUBSTÂNCIA AMILÓIDE Este método consiste na aplicação da coloração com Vermelho do Congo, seguida pela visualização da amostra através de uma luz polarizada. É considerada a técnica mais prática para detectar a substância amilóide. A observação microscópica da substância amilóide, o tecido elástico e os grânulos eosinofílicos é representada pela presença de materiais vermelhos. Os núcleos coram-se de azul. Estas preparações quando observadas com luz polarizada apresentam birrefringência exibindo uma cor verde maçã para a substância amilóide. PIGMENTOS E MINERAIS Muitas vezes encontramos, no tecido, alguns pigmentos que necessitam de uma caracterização para se definir a conclusão diagnóstica em questão. Os principais pigmentos que podem ser destacados são a melanina, a hemossiderina e a lipofuscina. O principal mineral é o cálcio. Quando se utiliza o corante conhecido como azul da Prússia ocorre a chamada reação de Perls. Desta forma a hemossiderina pode ser identificada, pois o ácido hidroclorídrico separa a proteína do ferro permitindo que o ferrocianido de potássio se ligue ao ferro na forma férrica e que se forme o ferrocianido férrico (azul da Prússia). Assim, os tecidos contendo hemossiderina e alguns óxidos e sais de ferro ficam azuis. No método de Fontana Masson para a melanina, é utilizada uma solução de prata amoniacal sem banho redutor. Apenas as substâncias capazes de reduzir diretamente os sais de prata, tais como a melanina, são evidenciadas. No final da reação, os grânulos argentafins e a melanina ficam de cor negra enquanto os núcleos e o citoplasma variam de rosa a vermelho. As lipofuscinas são uma mistura heterogênea de pigmentos nos quais se incluem os ceroides. Existem algumas técnicas que nos permitem evidenciar de alguma forma estes pigmentos. Dentre elas, destacamos o método de Sudam negro B, que deixa o pigmento negro, e o método de Zielh-Neelsen modificado deixando as lipofuscinas de cor magenta. No método de von Kossa para o cálcio, sais de prata são reduzidos para prata metálica negra pelo uso de luz ou de um revelador fotográfico, obtendo-se, no final, os sais de cálcio de cor negra. Entretanto, alguns pigmentos são formados em decorrência da presença de artefatos na amostra. Estes devem ser distinguidos dos pigmentos acima referidos. O mais freqüente é o pigmento de formol que surge sob a forma de um depósito castanho ou preto nos tecidos fixados em formalina cujo ph é inferior a 6,5. Quando a fixação é muito prolongada os tecidos fixados em formalina neutralizada acabam exiibindo este pigmento. Uma alternativa para evitar que este artefato se apresente é realizar a extração do pigmento da preparação antes de aplicar a coloração escolhida.

4 COLORAÇÕES PARA MICRORGANISMOS Estes procedimentos incluem as técnicas para as bactérias gram-positivas e gram-negativas, micobactérias álcool ácido-resistentes, fungos e parasitas. A coloração de Gram permite a distinção das bactérias gram-positivas, que retêm os complexos de cristal de violeta-iodina, e gram negativas, que são descoradas pelo álcool ou acetona e coradas pela safranina ou fucsina (corantes de contraste). No final, obtemos as bactérias gram-positivas azuis escuras e as gram-negativas vermelhas. A técnica da coloração de Ziehl-Neelsen baseia-se na capacidade que alguns microrganismos possuem de reter os corantes complexos básicos (tais como arbolfucsina) após forte descoloração com ácido-álcool. A resistência aos ácidos depende do elevado conteúdo em lipídios (ácidos micólicos e ácidos graxos de cadeias longas) das paredes celulares das micobactérias. A técnica de PAS, já referida é muito utilizada para evidenciar fungos, no entanto quando estão em pequena quantidade é preferível optar pelo método de Grocott. O método de Grocott permite evidenciar fungos e leveduras e baseia-se na redução da prata pelos grupos aldeídos resultantes da oxidação pelo ácido crômico. No final, os fungos são marcados de cor negra. É o método de eleição para detecção destes microrganismos principalmente quando sua concentração na amostra é reduzida. Para a detecção de protozoários, a técnica mais popular é a que utiliza o corante Giemsa. Com este método os protozoários e outros microrganismos ficam corados de azul escuro, enquanto que o fundo fica rosa ou azul claro. Os núcleos adquirem uma coloração próxima ao azul escuro. COLORAÇÃO DE GORDURAS As técnicas que permitem a identificação de gorduras são limitadas já que este tipo de material não pode ser aplicado em parafina. Isto ocorre porque as gorduras se dissolvem no xilol ou nos outros materiais usados durante o processamento. A técnica que utiliza o corante sudan negro (ou Sudan Black ) cora os ésteres de colesterol e os triglicerídeos de azul escuro e alguns fosfolipideos de tons próximos ao cinza. MATERIAL COD/EXAMES PRAZO DIAS 650 / HISTOPATOLOGIA COM COLORACAO ESPECIAL 86 / HISTOPATOLOGIA COM COLORACAO DE ROTINA - HE 648 / IMUNOHISTOQUIMICA PARA NEOPLASIA - PAINEL GERAL 649 / IMUNOHISTOQUIMICA DE NEOPLASIA - 1 MARCADOR

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