O QUE QUERO OBSERVAR E PORQUÊ???

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1 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULAC I - MICROSCOPIAS

2 O QUE QUERO OBSERVAR E PORQUÊ???

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4 M I C R O S C O P I A S

5 Início (1600): - Incorporação do microscópio aos estudos anatômicos; - Desenvolvimento de técnicas de preparo para a visualização dos materiais biológicos 1663 Robert Hooke 1689 Marcello Malpighi

6 (1689) Introdução da microscopia à medicina Estudo de capilares Marcello Malpighi ( ) Médicos: Rejeitaram microscopia inútil Descrições sobre os capilares eram falsas Anatomia comparada era irrelevante para medicina Anatomia humana só era útil para descrição

7 Fundamento: Sistema de lentes combinadas, que são colocadas de forma a ampliarem a imagem do objeto Interação da luz com o espécime Absorção ou Refração dos raios de luz Criar contrastes entre o objeto e o meio em que envolve

8 Microscópio Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia 1) De luz (ML) / óptico (comum) produção de imagens aumentadas de objetos não visualizados à olho nú Modificado (variações) com propósitos especiais Contraste de fase Polarização Invertido Fluorescência 2) Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de elétrons Microscópio eletrônico de transmissão (MET) Microscópio eletrônico de varredura (MEV)

9 Microscópio de luz comum / campo claro Componentes: Fonte luminosa luz branca (lâmpada com filamento de tungstênio) Sistema de iluminação Óptica lentes Mecânica ampliação condensação

10 Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho

11 Princípios da formação da imagem ao Microscópio objeto Imagem II Image m I F F F C C C Fonte de luz condensadora objetiva ocular Fonte de luz Lente condensadora Lentes objetivas Lente ocular O posicionamento estratégico das lentes no microscópio proporcionam a formação de uma imagem Invertida

12 Trajeto da luz Centralização do feixe de luz Iluminação de Köhler Iluminação perfeita Menos ocorrência de aberrações e irregularidades no trajeto luminoso

13 Objetiva (s) = próxima ao objeto Corrige aberrações = qualidade da imagem Tipos: acromática, semi-apocromática, apocromática, planacromática, planapocromática Imagem macroscópica do objeto Projeta imagem real e invertida Aumentos: 4x / 10x / 20x / 40x / 100x (imersão) Ocular (es) = imagem projetada pela objetiva Aumentos: 10x, 12x

14 Aumento final

15 Objetiva 4x = Vermelha 10x = Amarela 40x = Azul claro 100x = Preta / branca

16 Abertura Numérica 4X 10X 40X 100X AN = n.senα AN = Abertura numérica n = Índice de refração do meio de montagem sen = Fornecido pelo fabricante da lente A = Ângulo de abertura da objetiva α = Ângulo correspondente à metade de A AN = 0,12 (4x) AN = 0,34 (10x) AN = 0,60 (40x) AN = acima de 1 (100x)

17 Poder de Resolução X Limite de Resolução Bom microscópio: 1) Poder de Resolução (PR): Capacidade de uma lente (ou do próprio microscópio) em formar imagens com detalhes mínimos 2) Limite de Resolução (LR): Menor distância entre 2 pontos distintos do objeto, que poderão ser individualizados na imagem final > PR < LR

18 Quanto < o LR de uma lente > o PR do microscópio ou Quanto melhor for a capacidade de individualizar 2 pontos distintos do objeto (< LR) maior será a definição da imagem formada no aparelho ( > PR)

19 Sequência de passos Leia a etiqueta da lâmina material / corte / coloração Examine a lâmina macroscopicamente pode-se obter muita informação Objetiva de menor aumento (panorâmica) Ajustar área a ser observada, centralizando-a na platina Iluminação de Köehler Objetivas de aumentos maiores Observação: imagem invertida

20 Tipos de Microscópios Microscopia de Luz Microscopia convencional Microscopia de contraste de fase Microscopia de contraste interferencial Microscopia de campo escuro Microscopia de polarização Microscopia de fluorescência Microscopia confocal a laser Microscopia eletrônica Microscopia eletrônica de transmissão Microscopia eletrônica de alta voltagem Microscopia eletrônica de varredura Outros tipos de microscópio Microscopia de tunelamento quântico Microscopia de força atômica

21 Microscopia de Contraste de fase Princípios da Difração da Luz Anéis metálicos colocados no caminho da luz (Zerniké, 1950) Objetivas de contraste de fase: Ph (Phase) Retardo óptico e Refração da luz

22 Microscopia de Contraste de fase 2º Anel 1º Anel

23 Aplicações da Microscopia de Contraste de fase Análise do material biológico sem coloração prévia: 1. Culturas de células 2. Exames parasitológicos 3. Esfregaços e Raspagens de mucosas (Consultórios) 4. Sangue 5. Protozoários de ambientes aquáticos 6. Algas 7. Bactérias Sem coloração Bactérias Diferenças de índices de refração Cultura de células: neurônios

24 Aplicações da Microscopia de Contraste de fase Análise do material com coloração prévia Esfregaço de Sangue Divisão Celular em Raiz de Cebola

25 Microscopia de Contraste Interferencial Prismas ópticos posicionados no caminho da luz

26 Microscopia de Contraste Interferencial Os prismas modificam a fase da onda luminosa Contraste com o meio em que se encontra o material a ser analisado

27 Microscopia de Contraste Interferencial Microscopia de Normarski Defasagem dos comprimentos de onda Princípio Gera uma deformação na imagem Permite contraste interferencial Aumentando o relevo das superfícies do material analisado

28 Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial Observação de materiais biológicos sem coloração: 1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices dos parasitos (taxonomia) 2. Análise de massa seca celular organização e compactação de material biológico 3. Monitoramento de culturas celulares Algas Escamas

29 Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial Cultura Celular: macrófago Ácaro

30 Microscopia de Polarização 2 Filtros ou Prismas: 1º Polarizador Entre a fonte de luz e o condensador 2º Analisador Entre a objetiva e a ocular Filtros: Promovem a seleção de apenas um plano de direção de vibração das ondas luminosas Plano da luz polarizada (PLP) Observação: Microscopia de luz comum feixe de ondas luminosas direção de vibração em todos os planos

31 Microscopia de Polarização 2º PLP 1º

32 Anisotropias Ópticas Fenômenos de ordem espectral Dicroísmo (1 filtro polarizador) Birrefringência (2 filtros polarizadores cruzados perpendiculares)

33 Microscopia de Polarização Filtros polarizadores, quando colocados no caminho da luz e rotacionados a 90 o permitem a distinção de macromoléculas ditas anisotrópicas (birrefingentes ou dicróicas)

34 Birrefringência ocorre Cruzamos perpendicularmente os 2 filtros (polarizador e analisador) Componentes macromoleculares Birrefringentes: Anisotrópicos (brilho colorido ou não) Material realçado Não refringentes: Isotrópicos Outros componentes Indistintos em fundo escuro

35 Aplicações da Microscopia de Polarização 1. Análise de macromoléculas que apresentam graus ordenados de agregação: DNA, colágenos fibrilares, celulose, tubulina 2. Análise de células que apresentem organização interna de suas macromoléculas altamente cristalinas: célula muscular esquelética, espermatozóides (ordem molecular) 3. Análise de tecidos biológicos com ordem molecular nos arranjos macromoleculares: tecidos ósseos, cartilagens, dente 4. Análise de componentes cristalinos dos minerais 5. Outros: parede celular; amido.

36 Aplicações da Microscopia de Polarização Tecido ósseo Grãos de Amido

37 Microscopia de Luz Polarizada Exemplos: Birrefringência pode ser intensificada por corantes Colágeno - Xylidine Ponceau - Picro-sirius Cromatina / Matriz Extracelular - Azul de toluidina (ordem e agregação molecular ) Mesentério de rato. Coloração: Picro-sirius (fibras de colágeno: intensa birrefringência / brilhante / amarelo)

38 Aplicações da Microscopia de Polarização Coloração: Picro-sirius / Luz polarizada Tecido ósseo : sistema de Havers ou ósteon / fibras colágenas Tecido ósseo: osso esponjoso / fibras colágenas

39 Materiais biológicos podem apresentar: Birrefringência dependendo do grau de agregação de cristalinidade A observação e a medida das propriedades anisotrópicas (dicroísmo e birrefringência) Importantes para: a) Diagnóstico de patologias b) Estabelecimento ordem molecular Fases da vida celular

40 Microscopia de Campo Escuro Os microscópios de campo escuro apresentam um tipo especial de condensador - inclina a luz de tal modo que ela não atravessa o objeto A luz se dispersa Apenas os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema (objetivas e oculares)

41 Aplicações da Microscopia de Campo Escuro É empregada para estudos de pequenos materiais: Plâncton Bactérias Cristais Estruturas subcelulares (fimbrias e flagelos) Grãos de pólen plâncton fimbrias Microscopia de campo escuro da bactéria Leptospira spp

42 Microscopia de Fluorescência Propriedade física de algumas substâncias absorverem a luz, em um determinado comprimento de onda, e emitirem luz com comprimentos de onda maiores e níveis energéticos mais baixos Microscopia de fluorescência mostrando uma célula embrionária de Caenorhabditis elegans em divisão

43 Fluorescência natural: Existem componentes celulares ou moleculares naturalmente fluorescentes Clorofila Lignina de parede vegetal Elastina Colágeno A fluorescência visível neste nudibranqueo é dupla: os pigmentos verdes próprios da lesma e as algas vermelhas no seu intestino Algas (clorofila)

44 Outros componentes: Se ligam a substâncias fluorescentes fluorocromos emitem brilho contra fundo escuro DNA - verde Alaranjado de acridina (fluorocromo) RNA - vermelho Divisão celular Células meióticas do testículo de triatomíneos (barbeiro)

45 Microscopia de Fluorescência 1. Sistema óptico interage com pouca luz: Luz de mercúrio de alta pressão 2. Sistemas de filtros requeridos para detectar o brilho do material contra o fundo negro (a. Filtro de excitação; b. Filtro de barragem) Fonte de luz Fótons Filtro de excitação (seleciona os fótons de determinado comprimento) Objeto Emite luz fluorescente Filtro de barragem (luz de excitação é bloqueada) Imagem observada (formada pela luz que atravessa o filtro de barragem) Ocular Objetiva b. Filtro de barragem Fonte de luz a. Filtro de excitação

46 Microscopia de Fluorescência

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48 Aplicações da Microscopia de Fluorescência Devido a especificidade de cada tipo de filtro e devido ao desenvolvimento de vários corantes (fluorocromos) muitas são as utilizações da microscopia e fluorescência Fluorocromos: Alaranjado de acridina Eosina DAPI Rodamina Fluoresceina Emitem brilho contra fundo escuro

49 Aplicações da Microscopia de Fluorescência Identificação de compostos naturalmente fluorescentes Quantificação (Fluorometria): citoquímica normal e patológica Imunofluorescência: conjugação de anticorpos a fluorocomos que permite identificação de moléculas específicas Imunocitoquímica Hibridação insitu (FISH)

50 Aplicações da Microscopia de Fluorescência

51 Princípios da formação da imagem ao Microscópio Sem coloração Diferenças de índices de refração Com coloração Cores de interferência Com coloração fluorescente Campo escuro Células da mucosa oral

52 Microscopia confocal a laser Disponível mundialmente O microscópio confocal tem seu funcionamento baseado nos princípios da microscopia de fluorescência Utiliza laser como fonte de luz Permite a visualização: materiais espessos; corpos inteiros sem coloração prévia (vivos ou pré-fixados) Reconstrução do objeto tridimensionalmente Vários planos focais ou cortes ópticos (programas computacionais)

53 Aplicações da Microscopia confocal a laser 1. Todas as possibilidades já descritas para a microscopia de fluorescência convencional 2. Reconstrução 3-D de organismos microscópicos 3. Aumento de sinais de fluorescência de estruturas subcelulares. Exs: microtúbulos, miofilamentos, filamentos intermediários e elementos finos da matriz extracelular

54 Aplicações da Microscopia confocal a laser Células em prófase Células em apoptose: condrócitos

55 Aplicações da Microscopia confocal a laser Protozoário Macrófago

56 Aplicações da Microscopia confocal a laser Divisão celular / Fuso mitótico Grãos de Pólen

57 Início: Microscopia eletrônica Estudos do comportamento ondulatório dos elétrons Primeiros experimentos: Década de 1920 Busch (elétrons conduzidos por lentes eletromagnéticas) Semelhantes a fótons num sistema de vácuo 1931 Ruska Primeiro M.E. Poder de resolução: 0,5 nm 25 mil vezes a capacidade do olho humano Ernst August Friedrich Ruska ( )

58 Principais diferenças Microscópio de luz (ML) Microscópio eletrônico de transmissão (MET) Fonte Luz (porção inferior) Elétrons (porção superior) Lentes Vidro Eletromagnéticas Lentes de aumento (principal) Suporte para amostra Objetivas e oculares Lâmina de vidro Eletromagnéticas Grade de metal (telinha)cobre ou níquel Limite de resolução 0,2 µ 0,0002 µ Formação da imagem Transparência e coloração Variações de densidade e contrastação

59 Microscopia eletrônica Microscopia de Luz e Microscopia Eletrônica Questões importantes: Ampliação e Resolução

60 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e de Varredura (MEV) O avanço da microscopia eletrônica se deu a partir da descoberta de que os elétrons tinham comportamento ondulatório semelhante aos fótons de luz Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET) Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)

61 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

62 Microscópio eletrônico de transmissão (MET) Microscópio eletrônico de varredura(mev) Formação da imagem ao Microscópio eletrônico: Fonte de elétrons Caminha por um sistema de lentes eletromagnéticas (coluna) Feixe de elétrons Acelerados Lente condensadora Amostra Lentes objetivas (primeira imagem aumentada da amostra) Lentes intermediarias / projetivas (formação final da imagem) Imagem ampliada Anteparo fluorescente / monitor

63 Eletrodensa (escura) os elétrons encontram elementos como: ferro, ósmio, chumbo, ouro etc Eletrolúcida (clara) os elétrons encontram elementos como: hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio etc Observação: Imagem final ao MET Contrastação do material biológico (maioria eletrolúcidos): metais pesados

64 Microscopia Eletrônica de Transmissão Coloração negativa: vírus Tecido muscular Células epiteliais Cílio Hepátócito: Complexo de Golgi

65 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Scanning Electron Microscopy (SEM) Revela feições topográficas da superfície (detalhes) Imagens tridimensionais: - Vermes - Insetos - Células livres (animais/vegetais) - Embriões - Fragmentos geológicos Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra Guelras de um peixe

66 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Preparação das amostras Fixação (glutaraldeído / tetróxido de ósmio) Desidratação Secagem ( ponto crítico ) Evaporação com ouro na superfície a ser analisada Não necessita de contrastação

67 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

68 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Title: An Army of One" Category: Photo Microscopy Photographer: Freder Medina

69 Microscopia Eletrônica de Alta Voltagem ou Alta Aceleração Descrição de estruturas subcelulares (µ) Ex.: Citoesqueleto Aparelho grande: equivalente a um edifício de três andares - Alta aceleração eletrônica (500 a KV) - Permite estudos de corte grossos - Reconstrução tridimensional

70 Microscopia de Tunelamento Quântico Década de 1980 Potência visual do olho humano: 1 milhão de vezes (100x a capacidade do MET) = Estrutura atômica Benning / Rohrer (1986): Prêmio Nobel de Física Princípio: todos os corpos: - Características ondulatórias - Emissão de energia

71 Microscopia de Tunelamento Quântico Agulha que dista da superfície da amostra em 1Å (1 milionésimo de mm) Agulha: percorre a superfície da amostra corrente elétrica (tunelamento) Corrente atrai elétrons do material para a agulha tunel Agulha passa sobre um átomo corrente Agulha percorre os espaços entre os átomos corrente Esses sinais ( e ) são transmitidos para o computador imagens à superfície de vales e montanhas

72 Microscopia de Tunelamento Quântico Molécula de miosina Cromossomos 1 milhão de Vezes (100x a capacidade do MET) = ESTRUTURA ATÔMICA

73 Microscopia de Força Atômica É semelhante ao Microscópio de Tunelamento Quântico Diferença: - Presença de microespelho - Feixe de laser sobre a agulha Menor agressividade à amostra Detecção de detalhes de superfície Aplicações: - Obtenção de imagens em solução - Sequências de reações químicas ou modificações estruturais ao longo do tempo - Estrutura atômica de biomoléculas

74 Microscopia de Força Atômica Imagem de uma plaqueta obtida por microscopia de força atómica Imagem de eritrócitos obtida por microscopia de força atómica

75 Brasileiro ganha prêmio internacional para imagens de microscopia de força atômica Luciano Paulino da Silva, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, conquistou o segundo lugar na primeira edição do Prêmio Internacional de Imagens de Microscopia de Força Atômica. Reportagem publicada no dia 10/09/2007 A imagem de autoria do pesquisador da Embrapa, que mostra a superfície das células vermelhas do sangue depois do tratamento com peptídeos antibióticos, foi a única imagem não européia premiada dentre as mais de 250 inscritas. O prêmio visa o reconhecimento da importância das imagens de microscopia para os avanços da nanotecnologia em todo o mundo.

76 Scanning electron Microscopy imagem representa um único cristal de Wurtzite indium nitride (InN) sintetizado Title: Formosa Nano-Rose" Photographer: Dr. Kuei-Hsien Chen Vencedor do Science as Art Contest de 2008 Fim

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78 Planos de cortes

79 Planos de cortes Imagem microscópio = bidimensional Objeto de estudo = tridimensional