Microscopia Óptica. Micro Magnet. ImageJ. ibiology Microscopy Course. Sugestões de práticas. Bibliografia. Manoel Luis Costa

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1 1 Micro Magnet 2 Microscopia Óptica Manoel Luis Costa manoelluiscosta@ufrj.br Instituto de Ciências Biomédicas Universidade Federal do Rio de Janeiro RJ, 2018 Site com tutoriais interativos ImageJ 3 ibiology Microscopy Course /taking-courses/ibiology-microscopycourse.html Bibliografia Video microscopy - Inoué, Spring Plenum Press Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture - Wang, Lansing Taylor Methods in Cell Biology, 29 - Academic Press Sites ImageJ: Tutorials Sugestões de práticas 1. Prepare uma amostra de células de epitélio bucal colocando um pouco de saliva entre uma lâmina e lamínula. Faça iluminação de Koehler, 1) fechando o diafragma de campo, 2) acertando o foco da lente condensadora, 3) centralizando o diafragma de campo e 4) ajustando o diafragma do condensador. 2. Compare a imagem das células em campo claro, campo escuro, contraste de fase e contraste interferencial. 3. Teste as consequencias dos ajustes 1) da centralização dos anéis de fase, 2) do cruzamento dos polaróides, 3) da separação entre as imagens pelo prisma de Wollaston. 4. Faça a aquisição de imagens nas várias formas de iluminação, e compare a imagem adquirida com a imagem observada pela ocular do microscópio. 5. Capture imagens dos vários canais de fluorescencia, e compare os tempos da exposição automática da camera. Combine a imagem de fluorescência com fase e DIC no microscópio. 6. Faça no ImageJ uma superposição de imagem de beads fluorescentes em vários canais, e veja se existe deslocamento da imagem entre os canais. 7. Registre a imagem de uma lâmina com escala, e calcule a resolução espacial (pxls/um) para diferentes aumentos Calcule usando a fórmula de Abbe a resolução para cada lente, e calcule o tamanho do pixel que é projetado para a camera. Compare o tamanho deste pixel com a dimensão do pixel da camera. Qual lente é a melhor para a câmara?

2 7 8 menu menu 1 1. Características da imagem Características da imagem 2. Conceitos de óptica Conceitos de óptica 3. Contraste de fase Contraste de fase 4. Contraste interferencial Contraste interferencial 5. Fluorescência Fluorescência 6. Confocal Confocal 7. Super-resolução Super-resolução 8. Processamento de Imagem Processamento de Imagem Origens do microscópio 9 10 Origens do microscópio Robert Hooke Zacharias Jansen Casas de Jansen (1) e Lippershey (2) em Middelburg, Holanda Hans Lippershey Origens do microscópio 11 Leeuwenhoek Anton Leeuwenhoek h/18929-h.htm h.htm 12

3 Super-resolução Várias técnicas (STED, STORM, etc) estão ultrapassando o limite convencional da microscopia óptica, estabelecido por Ernst Abbe. 13 Super-resolução 14 Neurônio visualizado por microscopia óptica convencional e por STED, feita por Stefan Hell Microscópios atuais 15 Microscópios confocais 16 Técnicas de Microscopia Óptica e suas limitações 17 Características da Imagem 18 material vivo (tempo) material espesso (profundidade, imagem 3d) contraste (especificidade) resolução custo e dificuldade luz transmitida fluorescencia confocal iluminação lateral super-resolução campo escuro fase polarização dic Hoffman convencional FRAP FRET TIRF laser linha disco deconvolução iluminação estruturada multiphoton iluminação estruturada sted palm/storm 1. Pixel: definição, imagem na retina, fisiologia do olho, intensidade numa linha, imagem dinâmica 2. Resolução: definição e medida (lpm, dpi, tvl, etc), visualização, conteúdo de informação 3. Amostragem e aumento 4. Profundidade de cor: 8, 16 bit, grayscale, RGB, CMYK, lookup tables 5. Brilho e contraste: CTF, coeficiente linear e angular, curvas densitométricas, gama

4 19 Resolução na retina 20 Definição de resolução human eye # elementos distância #elem/dist 5 x 106 cones 0.2 mm 0.01º 0.2 m microscope photo negative 159 lpm printer A A BC BC 300 dpi analogic television 480 tvl digital television (HD) 1900 x 1080 pxls UHD or 4K television 3840 x 2160 pxls (8.3 megapixels) digital camera (Nikon D3200) 24.2 megapixels OBS: lpm: line pair per millimiter, dpi: dots per inch, tvl: television lines o olho tem aproximadamente 500 milhões de pixels (500mpxls) 21 Resolução: número de elementos da imagem (pixels) 22 Resolução negativo fotográfico detalhe grãos de prata: filme TMax filme TechPan 23 Varredura de lâmina Montamos um sistema de varredura de lâmina, com um estágio motorizado automático Zaber e aquisição em tempo intervalado em camera DP72. As imagens montadas podem ter resolução de centenas de megapixels, e cobrir áreas de vários milímetros. 24 Resolução: LIB

5 menu 25 menu Características da imagem Características da imagem 2. Conceitos de óptica Conceitos de óptica 3. Contraste de fase Contraste de fase 4. Contraste interferencial Contraste interferencial 5. Fluorescência Fluorescência 6. Confocal Confocal 7. Super-resolução Super-resolução 8. Processamento de Imagem Processamento de Imagem Visualização: resolvendo objetos NA 1 0,2 um Número de abertura (NA) da lente, onde NA = n. sen a Limite de resolução de uma lente num sistema óptico pode ser quantificado como sendod = 1,2. / ( NAobj + NAcond). A imagem de um ponto não é um ponto mas um disco de Airy, portanto existe uma função de espalhamento de luz no ponto, ou PSF. A resolução depende do comprimento de onda Contraste Disco de Airy Imagem teórica de um ponto: um ponto ampliado

6 Disco de Airy 31 Disco de Airy 32 Imagem teórica de um ponto: um ponto ampliado Imagem teórica de um ponto: um ponto ampliado NA 2 33 NA 3 34 NA 4 35 NA 5 36 NA = sen a. n

7 37 38 NA 6 Cálculo da resolução PSFs: NA pequena NA grande resolução = 1,22 NA objetiva + NA condensador 239 nm = 1,22 (550 nm) (1,4) + (1,4) Lentes Caminho da luz lâmpada diafragma campo lente condensadora lente objetiva lente ocular Ph3 Planapochromat 63 X 1.4 oel Aberrações cromáticas e esféricas. - acromáticas semi-apocromáticas ou fluorites apocromáticas Se a lente tiver correção para curvatura de campo, deve ter o prefixo PLAN / 0.17 Podem ser usadas lamínula de várias espessuras: 0,17 mm para lamínulas tipo 1 e 1/2 (anel de correção) lente coletora diafragma condensador estágio olho ou camera Caminho da luz olho ou camera lnt ocular dfg campo lnt coletora Componentes lnt condens do microscópio estágio lnt objetiva dfg condens lnt condens lâmpad a lâmpad a dfg campo lnt coletora

8 43 Componentes do microscópio 44 Componentes do microscópio Diafragmas 45 diafragma do condensador aberto fechado aberto fechado diafragma de campo aberto aberto fechado fechado