ESTUDO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DA GRANDE DOURADOS FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E AMBIENTAIS DISCIPLINA DE BIOLOGIA CELULAR BÁSICA PRÁTICA Prof. Dr. Marcos Gino Fernandes ESTUDO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO INTRODUÇÃO Os conhecimentos sobre as células progridem paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos de investigação. O desenvolvimento do microscópio óptico possibilitou o descobrimento das células. Igualmente importante foi o desenvolvimento de técnicas citoquímicas que permitiram a identificação e localização de moléculas constituintes das células. Já com o advento dos microscópios eletrônicos, tornou-se possível observar pormenores da estrutura celular. O aperfeiçoamento de métodos para a separação de organelas e para o estudo in vitro de suas moléculas proporcionou maior conhecimento sobre as células. Mais recentemente, as técnicas de manipulação do genoma permitem um profundo conhecimento das moléculas das células e suas funções. O MICROSCÓPIO ÓPTICO No estudo das ciências biológicas tem sido particularmente importante o microscópio óptico, uma vez que permite observações que estão fora do alcance da visibilidade direta do olho humano. A estrutura pormenorizada dos seres vivos e essa infinidade de coisas tão pequenas que já se conhecem, estariam ainda no vasto campo da ignorância humana se não existisse o microscópio. No

2 Estudo do microscópio óptico Marcos Gino Fernandes. 2 entanto, a sua missão está ainda muito longe de se julgar cumprida e dele muito ainda se deve esperar. Nos finais do século XVI, depois de quatro séculos a aperfeiçoar e dar novas utilizações às lentes, foi criada a lupa por Galileu e, usando-a, efetuou as primeiras observações de objetos e seres. Com ele os cientistas da época foram capazes de encontrar nos seres que já conheciam novos pormenores e características. No século XVI, a construção e aperfeiçoamento do microscópio, particularmente do sistema de lentes, expandiu-se. Antonie Van Leeuwenhoek e Zacharias Jansen, fabricantes de óculos, desenvolveram os primeiros microscópios simples e compostos, respectivamente. Estes aparelhos utilizavam a luz refletida pelo objeto fortemente iluminado. Vários modelos foram a seguir construídos, entre os quais alguns de valor histórico, como por exemplo, o de Robert Hooke. Mas teria de decorrer quase um século até que o microscópio óptico composto, sucessivamente aperfeiçoado, fosse capaz de permitir imagens de grande qualidade. CONSTITUIÇÃO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO Atualmente, o microscópio óptico (M.O.) é constituído por duas partes uma parte mecânica e uma parte óptica. Cada parte engloba uma série de componentes constituintes do microscópio. A parte mecânica serve para dar estabilidade e suportar a parte óptica. Esta parte é constituída por: Pé ou Base suporta o microscópio, assegurando a sua estabilidade. Braço ou Coluna peça fixa à base, na qual estão aplicadas todas as outras partes constituintes do microscópio. Tubo ou Canhão cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade superior a ocular e na inferior o revólver com objetivas. Platina peça circular, quadrada ou retangular, paralela à base, onde se coloca a preparação a observar, possuindo no centro um orifício circular ou alongado que possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador. Parafuso Macrométrico engrenagem que suporta o tubo e permite a deslocação da

3 Estudo do microscópio óptico Marcos Gino Fernandes. 3 platina. É indispensável para fazer a focagem. Parafuso Micrométrico imprime ao tubo ou à platina movimentos de amplitude muito reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do microscópio. Revólver disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta de duas a quatro objetivas de diferentes ampliações: por rotação é possível trocar rápida e comodamente de objetiva. A parte óptica é constituída por: Sistema de Oculares e Sistema de Objetivas o conjunto de lentes que permitem a ampliação do objeto. A ampliação dada pelo microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela ampliação da ocular. Fonte Luminosa existem vários tipos de fontes luminosas, podendo ser uma lâmpada (iluminação artificial), ou um espelho que reflita a luz solar (iluminação natural). Os dois tipos de iluminação têm virtudes e defeitos, mas ambos destinam-se à iluminação da preparação, possibilitando assim a sua visualização. Condensador distribui regularmente, no campo visual do microscópio, a luz refletida pelo espelho. Situado entre a fonte de luz e a platina, possui um sistema de lente convergentes cuja finalidade e projetar um cone de luz sobre a preparação a ser examinada ao microscópio (podendo ser aproximado ou afastado da platina, por um botão) Diafragma regula a intensidade luminosa no campo visual do microscópio. As partes mais importantes de um microscópio são suas lentes. As lentes objetivas são aquelas que ficam próximas do objeto a ser analisado. O microscópio usado em aula consta de quatro objetivas: uma que aumenta 4X, outra cujo aumento é de 10X, uma terceira com aumento de 40X e uma última (de imersão) com aumento de 100X. Cada uma delas é identificável pela notação em sua lateral referente ao aumento e à abertura numérica. Dessa forma, a objetiva projeta uma imagem aumentada do objeto em direção à ocular, que novamente amplia sobre a retina, sobre uma tela ou sobre uma chapa fotográfica.

4 Estudo do microscópio óptico Marcos Gino Fernandes. 4 Uma lente ocular é constituída por duas lentes convergentes. Sua função é ampliar a imagem enviada pela objetiva. A ampliação dada pela ocular também está gravada nas laterais dessas lentes. O microscópio a ser utilizado em laboratório é equipado com uma ou duas oculares trazendo a notação 10X, o que significa que estas aumentam a imagem produzida pelas objetivas em 10X. A ampliação total da imagem dada por uma combinação de lentes é igual ao aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular. Assim, por exemplo, uma preparação focalizada com uma objetiva que amplia 40X e com uma ocular de 10X, mostra o preparado ampliado 400X. Quanto à lente objetiva de imersão, esta só deve ser utilizada após o estudo com a lente de 40X. Esta objetiva oferece aumento de 1000X e distingue-se das demais por ser necessário, para sua utilização, o uso de óleo de cedro ou sucedâneo sintético para imersão da lente. O óleo de imersão se faz necessário pelo fato de que essa lente fica muito próxima do objeto a ser analisado, chegando a tocálo. Essa objetiva possui ainda uma armação retrátil de proteção para evitar a quebra do preparado e danos à lente. Os limites do sistema de lentes são impostos artificialmente através do poder de resolução (P. R.) de cada equipamento. Na prática, o P.R. (capacidade de separar detalhes) é expresso pela L.R. (limite de resolução = menor distância entre dois pontos para que apareçam individualizados). O L.R. determina a riqueza de detalhes da imagem fornecida por um sistema óptico, dependendo essencialmente da objetiva (ou seja, de sua abertura numérica A.N., determinada pelo fabricante, que confere a precisão da lente) e do comprimento de onda da luz utilizada (radiação). Portanto, a propriedade de aumentar a imagem só tem valor prático se acompanhada de um aumento paralelo do P.R. (i. é., alto L.R.). O L.R. é igual a (k x )/A. N., onde k é uma constante estimada em 0,61 por alguns e 0,5 por outros e é o comprimento de onda de luz empregada. Na prática, usa-se luz branca, constituída por diversos comprimentos de onda. Para o cálculo do L.R. usa-se o comprimento de onda de faixa verde-amarelo (0,55m), para o qual o olho humano é mais sensível. CARACTERÍSTICAS DA IMAGEM DO M.O.

5 Estudo do microscópio óptico Marcos Gino Fernandes. 5 O objeto a ser observado deve ser colocado muito perto do foco objeto do sistema da objetiva, para que se forme uma imagem real, invertida, de maiores dimensões, que vai servir de objeto em relação à ocular. Esta dá uma imagem virtual, invertida (nos dois sentidos) em relação ao objeto a ser observado, que deve formar-se entre o ponto próximo e o ponto remoto do olho do observador, ou seja, virtual. A partir da observação de uma imagem qualquer ao microscópio, pode-se reparar que como em conseqüência desta ser invertida, a imagem para se deslocar num determinado sentido, a preparação tem que se deslocar em sentido oposto. Se a objetiva fornecer uma imagem defeituosa com aberrações cromáticas, esféricas ou com cortes do campo a ocular vai ampliar as imperfeições dessa imagem. Estes defeitos do sistema óptico combatem-se com sistemas de lentes, algumas das quais com papel corretor, de modo que, as imagens sejam nítidas, planas e com pormenores bem separados. No M.O., a ampliação e o campo de visualização são inversamente proporcionais, ou seja, quanto maior for a ampliação, menor será a área da preparação observada. O contrário também se verifica. PROFUNDIDADE DE CAMPO DO M.O. Quando se utiliza o microscópio podem-se observar preparações com três dimensões, ou seja, com largura, comprimento e profundidade. Se a preparação observada contiver dois cabelos cruzados, de modo que não se encontrem num plano comum, um encontrar-se-á num plano mais abaixo que o outro. Esta diferença de planos não se conseguiria detectar a olho nu, mas quando a preparação é observada ao microscópio, são constatáveis algumas conseqüências dessa diferença de planos. Quando se observa nitidamente certo plano, aqueles que se encontrarem acima ou abaixo plano focado ficam desfocados, apenas se conseguindo ver de modo pouco nítido. Isto significa que o campo do microscópio tem, também, certa profundidade, não sendo possível focar simultaneamente dois planos diferentes. Como se sabe, a profundidade de campo do microscópio é muito pequena, o que implica que os objetos examinados ao microscópio devem ser de muito pequena espessura.

6 Estudo do microscópio óptico Marcos Gino Fernandes. 6 A operação de focagem é tanto mais delicada quanto menor for a distância focal do sistema, ou seja, quanto maior for a ampliação, mais delicada será a focagem e menos nítido ficará o plano que não estiver focado. Devido a isto, é importante que, durante a observação, se proceda a uma manobra constante do parafuso micrométrico de modo a poderem-se visualizar nitidamente pormenores nos diferentes planos, visualizando todos os campos existentes, um de cada vez. RELAÇÃO ENTRE A ÁREA OBSERVADA E A AMPLIAÇÃO UTILIZADA A medida do campo do microscópio pode ser feita com a ajuda de micrômetros de objetiva ou de ocular. Na sua falta, o papel milimétrico permite medir, aproximadamente, o campo do microscópio nas diferentes ampliações realizadas pelas lentes incorporadas em alguns componentes. A área da superfície observada através do microscópio composto é sempre relativamente restrita e depende da ampliação utilizada. A área do material observado varia na razão inversa da ampliação que se utiliza. Para ampliações maiores, a área observada é apenas de uma fração do milímetro. A redução progressiva da área observada é, no entanto, acompanhada de um aumento de detalhes. As maiores ampliações permitem a observação de áreas restritas, mas revelam pormenores não detectados com pequenas ampliações. Torna-se, portanto, desnecessária a montagem de grandes fragmentos para observação microscópica. Também objetos de dimensões superiores às da área do campo não podem ser completamente abrangidos. Pode-se então concluir que se deve iniciar a observação microscópica utilizando pequenas ampliações, que permitam captar uma idéia de conjunto. A preparação deve ser percorrida nos vários sentidos a fim de se localizar a zona de maior interesse. Dessa zona selecionam-se os elementos de maior importância, centrando-os, e só depois se deve passar a objetivas de poder ampliador maior. Estas permitirão observar detalhadamente os pormenores desejados da preparação em causa. CUIDADOS COM O MICROSCÓPIO

7 Estudo do microscópio óptico Marcos Gino Fernandes. 7 Devido aos componentes do microscópio serem de alta precisão, e porque este aparelho é um instrumento caro, requer cuidados especiais de transporte, utilização e manutenção. Portanto, esse instrumento deve ser guardado e manipulado corretamente, seguindo sempre os seguintes passos quando de sua utilização: Tirar a capa. Desenrolar o fio totalmente e ligá-lo à tomada. Limpar a lente ocular com pano limpo ou papel macio. Colocar a lâmina sobre a platina completamente abaixada. Ligar a fonte de luz. Iniciar a observação com a lente de menor aumento. Elevar gradativamente a platina, com a utilização do parafuso macrométrico. Focalizar com o auxílio do micrométrico. Fazer as devidas observações nesse aumento. Passar para os aumentos seguintes, utilizando apenas o revólver (não girar tocando nas lentes), focalizando novamente, agora somente com o uso do parafuso micrométrico. Após o estudo completo do objeto, voltar à primeira objetiva, abaixar toda a platina e retirar a lâmina. Proceder à visualização de outra lâmina, ou apagar a luz e limpar o microscópio cuidadosamente, com pano limpo ou papel macio. Manter a platina abaixada na primeira objetiva. Desligar o microscópio e enrolar o fio. Cobrir o microscópio.