Materiais necessários que não estão incluídos

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1 DNA especifico com marca fluorescente Produto: 1. DNA marcado com moléculas fluorescentes (sonda). 2. Buffer(tampão) de Hibridação 3. Reagentes para solução de montagem (DAPI + antifade) Estas sondas estão desenhadas para serem utilizadas nas células interfásicas ou metafasicas, obtidas através de procedimentos padrões citogenéticos, veja:o Manual ACT CytogeneticsLaboratory. 2nd ed. New Cork: Raven Press; Eliminado: <#> Eliminado: Materiais necessários que não estão incluídos Solução ultra pura de Formamida 2XSSC* Etanol em solução 70, % Pepsina* Detergente não iônico ph-medidor ou papel para medir ph Coverslip/lamínula Soluções de lavado (1 y 2)* Adesivo de contato 0,2 ou 0,5ml PCR tubos Frascos coplin Câmera úmida Termômetro calibrado * Ver abaixo as instruções de preparação. Equipamento necessário: Microscópio fluorescente: nem sempre o microscópio usado nas reações imunoistoquímica ou em outras analises fluorescentes são apropriado. Os requisitos para observar corretamente as reações FISH são os seguintes: o o o Fonte de excitação: Recomenda-se uma lâmpada de 1oo watts de mercúrio com uma vida útil de 200hs. É necessário que uma vez posicionada, a lâmpada esteja corretamente alinhada. Objetivos: para localizar o alvo (interfases ou metafases) são recomendadas objetivas de 10, 20 e/ou 40x. A análise da reação requer de uma objetiva fluorescente de imersão com uma abertura numérica Filtros de emissão- excitação: Cada flourocromo requer um filtro diferente. Os requisitos para nossa sonda estão na tabela abaixo: 1

2 Fluorocromo Excitação(nm) Emissão (nm) Verde VERMELHO DAPI Microcentrifuga Micropipetas para 1 a 10 µl volumes Vórtex Timer/ cronômetro Banho- maria Incubadora Preparação de Reagentes: 2XSSC: Cloreto de sódio(nacl) 300mM Citrato de sódio desidratado(na 3 C 6 H 5 O 7 ) 30mM Ajustar o ph a 7.0 com gotas de ácido clorídrico (HCl) 1N Solução de Desnaturação: Formamida Ultrapura 70% 2XSSC 30% AjustarpH:7-8. Armazenar a 4ºC. descartar depois de 7 dias. Solução Pepsina: Diluir 0.5 mg de pepsina em 1ml de ácido clorídrico(hcl) 0,1N. Solução de lavado 1: Em um coplin adequado para 80ml, adicione 16ml de 2XSSC, 64ml de agua destilada e 0.240ml de detergente não iônico. Solução de lavado 2: Em um coplin adequado para 80ml, adicione 80ml de 2XSSC e 0.80ml de detergente nãoiônico 2

3 Precauções e advertências (leia com atenção): Reagente analítico. Somente para investigação. Este produto Não está aprovado para diagnóstico ou uso terapêutico As reações e interpretações dos mesmos devem ser realizadas por profissionais qualificados e corretamente treinados. Toda amostra biológica deve ser tratada como possível portadora de agentes infecciosos. Evitar expor as amostras a acido ou alcalinos em concentrações elevadas e altas temperaturas. Estes fatores podem danificar o DNA e causar falhas na reação FISH. A falha ou omissão de qualquer passo do protocolo detalhado a continuação pode levar a resultados errôneos ou inaceitáveis. O buffer(tampão)hibridizador contém formamida, um teratogênico e portanto deve-se evitar o contato com a pele ou membranas mucosas. Recomenda-se o uso de aventalde trabalho durante o procedimento Todo material perigoso deve ser jogado fora de acordo com as normas da sua instituição. 3

4 Protocolo de utilização Considerações preliminares: Durante a aplicação deste protocolo não é necessário agir em condições de luz tênue. As sondas LIVE foram desenvolvidas para não perderem sua fluorescência durante curtos períodos (horas) de exposição à luz artificial. Embora seja altamente recomendável mantê-las a -20 ºC, as sondas LIVE não perdem sua ação depois de 48hs a temperatura ambiente. O buffer(tampão)hibridizador mostrará resultados em 30 minutos de hibridização. Uma hibridização maior a 30 minutos não interfere na qualidade da reação. Recomenda-se usar 45ºC para 30 minutos até aproximadamente 8hs de hibridização. Se a reação for mostrada no dia seguinte, a temperatura deverá ser de 37ºC. Esfregaço/smear celular Para o esfregaço celular é muito importante não usar temperaturas extremas (chamas, chama- secagem) Tratamento prévio Em geral as sondas LIVE funcionam bem sem qualquer tratamento prévio, contudo a presença de fragmentos celulares ou hibridização em algumas amostras como mucosa bucal, amniocitos, etc. requerem que se limpe o DNA especifico para melhorar a hibridização. Sobre a amostra do esfregaço aplique uma gota de solução de Pepsina. Adicione um Coverslip/lamínula. Incube em uma câmara úmida a 37ºC (o tempo varia com a severidade do tratamento, com 5 minutos como mínimo). Descarte o Coerslip/lamínula e enxague rapidamente embaixo de agua corrente. Desidrate em series de etanol: 70,90 y 100% 1 minuto em cada um. Espere que se seque completamente. 4

5 Reação de hibridização flourescente in situ Protocolo 1: Desnaturação usando Fornamida Preparação da sonda: Descongele o tubo da sonda, misture no vortex Centrifugue rapidamente Descongele o buffer(tampão) hibridização Em um tubo PCR adicione: 7µl de buffer(tampão)hibridização 1µl de sonda Misture no vortex Centrifugue rapidamente Desnaturação: NOTA: Pelo menos 30 minutos antes da desnaturação, aqueça a solução a temperatura desejada. Com um termômetro calibrado certifique a temperatura no interior do COPLIN. Na parte de tras da lâmina marque a região parahibridizar(os 8µl hibridram aproximadamente uma região de 22x22mm). Mergulhe a lâmina na solução desnaturação a 60-75º por 1-5min (dependendo da idade do esfregaço/smear) Usando pinças retire a lâmina e imediatamente mergulhe em 70% etanol agitando por alguns segundos para eliminar a formamida restante. Desidrate em etanol 70, 90 e 100% 2 minutos cada um. Espere que se seque completamente. Desnature a solução desonda a uma temperatura mínima de 70ºC por 5 minutos. Isto pode ser feito com um dispositivo controlador de temperatura ou simplesmente deixando o tubo em água fervendo em um suporte de poliestireno Coloque a solução de sonda em gelo por algunos segundos. Centrifugue rapidamente para recolher a parte evaporada. Adicione a solução de sonda na região para hibridizar. Coloque um COVERSLIP/LAMINULA/ do tamanho apropriado. Sele as bordas com adesivo de contato removível ou coloque uma folha de Parafilm que ultrapasse o tamanho do coverslip/lamínula. Hibridação: O buffer hibridizador LIVE outorga excelente resultados com qualquer sonda em somente 30 minutos de incubação a 45ºC Coloque a lâmina montada em uma câmara úmida. Incubar pelo menos por 30 minutos a 45ºC ou de um dia para o outro a 37ºC 5

6 Protocolo 2: Desnaturação com Hidróxido de Sódio Este protocolo preserva de maneira ideal a morfologia dos cromossomas, permite a reação FISH no mesmo dia da preparação do esfregaço-smear celular e dá resultados de alta qualidade. Além disso, de acordo com a qualidade da suspenção celular é possível observar um padrão de bandas similar ao da banda G. NaOH as vezes pode gerar autofluorescência em um núcleo e /ou cromossomas. Neste caso se recomenda envelhecer levemente os esfregaços/smear a 37-45ºC 2 horas. Preparação da sonda: Descongele o tudo da sonda, misture no vortex Centrifugar rapidamente Descongele o buffer(tampão) hibridização Em um tubo PCR adicionar: 7µl de buffer(tampão) hibridização 1µl de sonda Misturar no vortex Centrifugar rapidamente Desnaturação: Na parte de trás da lâmina marcar a região para hibridizar (os 8µl preparados hibridam uma região aproximada de 22x22mm). Mergulhe a lâmina em uma solução de NaOH 0.1M em etanol 70% a temperatura ambiente por 6 minutos. Utilizando pinças retire a lâmina e imediatamente mergulhe em etanol 70% agitando por unos segundos para eliminar o NaOH restante. Desidratar em etanol 70, 90 e 100% 2 minutos cada um. Esperar que seque completamente. Desnaturar a solução de sonda a uma temperatura mínima de 70ºC por 5 minutos. Isto pode ser feito em dispositivo controlador de temperatura ou simplesmente deixando o tubo em agua fervendo em um suporte de poliestireno. Coloque a solução sonda em gelo por unos segundos. Centrifugue rapidamente para recolher a parte evaporada. Adicione a solução de sonda na região para hibridizar Coloque um coverslip/lamínula de tamanho apropriado. Sele as bordas com adesivo de contato ou coloque uma folha de Parafilm que exceda o tamanho do coverslip/lamínula. NOTA: uma vez terminado o processo anterior, é uma boa alternativa colocar a lâmina em uma superfície quente a 71ºC por 4 minutos. Em geral neste passo extra acontece melhores resultados, contudo se pode diminuir levemente a qualidade da morfologia dos cromossomas Hibridização: O Buffer(tampão)hibridizador LIVE oferece excelentes resultados com qualquer sonda em somente 30 minutos de incubação a 45ºC. Coloque a lâmina montada em uma câmara úmida a 45ºC. incubar pelo menos por 30 minutos a 45ºC ou de um dia para o outro a 37ºC. 6

7 Protocolo3: Co-desnaturação Este protocolo foi desenhado para unificar o tempo da co-desnaturação com a temperatura. Aqui, os parâmetros são os mesmo para células esfregaços/smear preparadas no dia ou as guardadas a -20ºC Preparação da sonda: Descongele o tubo da sonda, misture no Vortex Centrifugue rapidamente Descongele o buffer(tampão) hibridização Em um tubo PCR adicione: 7µl de buffer(tampão) hibridização 1µl de sonda Misture no vortex Centrifugue rapidamente Co-Desnaturação: Na parte de trás da lâmina marcar a região para hibridizar (os 8µl preparados hibridam uma região aproximada de 22x22mm). Adicione a sonda na região para hibridizar. Coloque um coverslip/lamínula de tamanho apropriado. Sele as bordas com adesivo de contato removível ou coloque uma folha deparafilm que exceda o tamanho do coverslip/lamínula. Coloque a lâmina montada em uma superfície quente (hibridizador,placa termostática, etc.). Em ocasiões é conveniente colocar uma gota de água sobre a chapa aquecedora e depois colocar sobre esta a lâmina montada, desta forma se consegue uma película de água entre a lâmina e a superfície quente melhorando a transferência de temperatura. Um tratamentode 15 minutos a 71 C tem funcionado bem independente da idade doesfregaço/smears. Hibridização: O Buffer(tampão)hibridizador LIVE oferece excelentes resultados com qualquer sonda em somente 30 minutos de incubação a 45ºC. Coloque a lâmina montada em uma câmara úmida a 45ºC. incubar pelo menos por 30 minutos a 45ºC ou de um dia para o outro a 37ºC. 7

8 Reação de hibridização flourescente in situ Revelado: (O mesmo procedimento para os protocolos 1, 2 e 3) Nota: Pelo menos 30 minutos antes da lavagem, aqueça a solução de lavado 1 para 71 C (+/-1ºC).Com um termômetro calibrado confira a temperatura dentro do coplin. Descongele a solução de lavado 2 a temperatura ambiente. Retirea lâmina da câmera úmida. Com cuidado retire o adesivo ou a folha deparafilm Mergulhe a lâmina em uma solução 2XSSC a temperatura ambiente até o coverslip/lamínula cair. Mergulhe a lâmina na solução de lavado 1 por exatamente 2 minutos Mergulhe a lâmina na solução de lavado 2 pelo menos 1 minuto. Retire a lâmina e drene o excesso de liquido ligeiramente. Coloque uma gota na solução de montagem na região hibridizada. Coloque o coverslip/lamínula do tamanho apropriado. Drene o excesso da solução de montagem pressionando com cuidado e secando com toalhas de papel. Remova alguma bolha de ar pressionando com cuidado. A reação está pronta para ser lida 8

9 Protocolo para uso (Protocolo #1) esfregaço/smear Celular Preparação da Sonda DNA sonda + Buffer Hibridização Desnaturação Formamida 70% Desidratar em etanol Desnaturação 70ºC ou mais Hibridização 45ºC (30 minutos a pelo menos 8 horas) 37ºC (Overnight) Lavados Montagem DAPI + Antifade Análise 9

10 Protocolo para uso (Protocolo #2) Esfregaço/smear celular Feito no dia Envelhecido a 37-45ºC Preparação sonda DNA Sonda + Buffer Hibridização Desnaturação Hidroxido de sodio0.1m 6minutos Tºambiente. Desidratar em etanol Desnaturação 70ºC oumais, 5 minutos Alternativa 71ºC, 4 minutos Hibridização 45ºC (30 minutos a pelo menos 8 horas) 37ºC (Overnight) Lavagens Montagem DAPI + Antifade Analise 10

11 Protocolo para uso (Protocolo #3) Esfregaço/smear celular Feito no dia Envelhecido a 37-45ºC Preparação sonda DNA Sonda + Buffer Hibridização Co-desnaturaçao 71ºC 15 minutos Hibridização 45ºC (30 minutos pelo menos 8 horas) 37ºC (Overnight) Lavados Montagem DAPI + Antifade Analise 11